【5A版】细胞分离与培养技术.ppt

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1、临床药理研究所细胞分离与培养技术1现代生物技术基因工程技术细胞工程技术酶工程技术发酵工程技术细胞培养2细胞分离技术从血液、体液中分离细胞从原代组织中分离细胞从原培养容器中分离细胞--传代培养原代培养3细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞采血方法：人静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血；小动物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺法、断颈取血或股动脉放血。兔耳静脉或动脉穿刺取血。4细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞血液抗凝方法：肝素法：按每ml血液约用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4µl）；草酸盐法：取草酸钾0.2g，草酸铵0.3g，加

2、双蒸水10ml溶解后，取0.2ml放入5ml的试管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此试管中，轻轻摇晃；枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/LEDTA2µl。5细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞体液标本采集：在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔（如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。膝关节腔穿刺胸腔穿刺6细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞血样中红细胞和白细胞的分离：利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，

3、以自然沉降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。抗凝血，室温或37℃下直立静置30-60min，红细胞沉降至下层，中间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3︰l量混合于离心管中，直立静置30-60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。7细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞血中单个核细胞的分离：单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。淋巴细胞分离液8细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞血中单核细胞的分离：利用细胞

4、在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离单个核细胞悬液多将悬液放入12cm直径的培养皿中，于37℃培养箱中静置30-60min。此时单核细胞贴壁，而淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗培养皿以尽量洗下未贴壁细胞（淋巴细胞）。用Hanks液强力冲洗吹打与震荡，将贴壁的单核细胞冲落或用刮刀轻刮，收集贴壁的单核细胞。计数后分别制备所需浓度的细胞悬液。9细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），所以可将其与T淋巴细胞分离。10具体步骤：单

5、个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的细胞悬液。先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤维柱，冲洗液尽量流净。将尼龙柱预温37℃，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维柱，不使流出，37℃温箱内静置l小时。取下注射针头，用预温37℃含20%小牛血清的RPMI-1640培养液冲洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。从注射器内取出尼龙纤维，在4℃的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴壁法将其分离）。收集的T、

6、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g，7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。11细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞：磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。12细胞分离技术--从血液、体液

7、中分离细胞免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。13细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细胞(CD14)、胰岛细

8、胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）)、多种肿瘤细胞等。14细胞分离技术--从血液、体液中分离细胞15细胞分离技术--从血液、体液中