SNT2135-2008-蜂蜜中转基因成分检测方法普通PCR方法和实时荧光PCR方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１３５—２００８蜂蜜中转基因成分检测方法普通犘犆犚方法和实时荧光犘犆犚方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犵犲狀犲狋犻犮犪犾犾狔犿狅犱犻犳犻犲犱犮狅犿狆狅狀犲狀狋狊犻狀犺狅狀犲狔—犆狅狀狋犲狀狋犻狅狀犪犾犘犆犚犪狀犱狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１３５—２００８前言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督

2、管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草。本标准主要起草人：饶红、冯骞、陈广全、付浦博、曾静、汪琦、张惠媛。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１３５—２００８蜂蜜中转基因成分检测方法普通犘犆犚方法和实时荧光犘犆犚方法１范围本标准规定了蜂蜜中转基因成分的定性检测方法。本标准中适用于以转基因棉花、转基因油菜等作为蜜源植物采集的蜂蜜或受到转基因作物污染的蜂蜜中的转基因成分的检测。２规范化引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用

3、文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）ＳＮ／Ｔ１１９３基因分析检测实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１１９４植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法３术语、定义和缩略语３．１术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１．１聚合酶链式反应狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀，犘犆犚体外酶催合成特异

4、ＤＮＡ片段的方法，模板基因序列先经高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖（ｄＮＴＰ）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。３．１．２实时荧光犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚在ＰＣＲ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个ＰＣＲ进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析的方法。ＰＣＲ扩增时在加入一对引物的

5、同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光集团和一个淬灭荧光集团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，犜犪狇酶的５’３’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光集团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与ＰＣＲ产物形成完全同步。就是通过对ＰＣＲ扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量ＰＣＲ反应中，引入了一种荧光化学物质，随着ＰＣＲ反应的进行，ＰＣＲ反应产物不

6、断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。３．１．３定性检测狇狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲犱犲狋犲犮狋犻狅狀对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。１版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１３５—２００８３．２缩略语３．２．１下列缩略语适用于本标准。ＧＭＯｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｏｒｇａｎｉｓｍ转基因生物。３．２．２ＣａＭＶ３５Ｓ３５ＳｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍＣａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ．ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ花椰菜花叶

7、病毒３５Ｓ启动子。３．２．３ＮＯＳｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｏｆｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子。３．２．４ＣＰ４ＥＰＳＰＳ５ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ５莽草酸３磷酸合成酶基因。３．２．５ＩＶＲＩｎｖｅｒｔａｓｅ１ｇｅｎｅｆｒｏｍｍａｉｚｅ玉米转化酶１基因。３．２．６ＮｐｔＩＩｎｅｏｍｙｃｉｎ３’ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ新霉素３’磷酸转移酶基因。３．２．７

8、ＣｒｙＩＡ（ｂ）：ａｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｅｎｃｏｄｅｄｔｈｅｆｉｒｓｔ６４８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｅｔｒｕｎ