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《constructionandidentificationoflentiviralvectorofrnainterferenceofsmad3gene》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、Smad3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定基金项目:国家自然科学基金资助项目(30500539) SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(30500539) 作者简介:王延洲(1974-),男,吉林省人,博士研究生,医师,助教,主要从事妇科泌尿学方面的研究,发表论文7篇。电话:(023)68765403 通信作用:徐惠成,电话:(023)68765402王延洲，梁志清，刘晓芳，徐惠成 (第三军医大学第一附属医院，重庆400038)Construct
2、ionandidentificationoflentiviralvectorofRNAinterferenceofSmad3geneWANGYan-zhou,LIUXiao-fang,XUHui-cheng,LIANGZhi-qing(DepartmentofDepartmentofObstetricsandGynecology,FirstAffiliatedHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)Toconstructalentivira
3、lvectorofRNAinterference(RNAi)ofSmad3gene.METHODS:TheeffectivesequenceofsiRNAtargetingSmad3genewasconfirmedinourpreviousstudy.ThecomplementaryDNAcontainingbothsenseandantisenseOligoDNAofthetargetingsequencewasdesigned,synthesizedandclonedintothepGCSIL-GFPvector,Th
4、eresultinglentiviralvectorcontainingSmad3shRNAwasconfirmedbyPCRandsequencing.293TCellswerecotransfectedwithlentiviralvectorGC-shSmad3、pHelper1.0andpHelper2.0.ThetiterofviruswastestedaccordingtotheexpressionlevelofGFP.RESULTS:PCRandDNAsequencingdemonstratedthatthel
5、entivirusRNAivectorofGC-shSmad3producingSmad3shRNAwasconstructedsuccessfully.Thetiterofconcentratedviruswas3×108TU/ml.CONCLUSION:ThelentivirusRNAivectorofSmad3wasconstructedsuccessfully.【Keywords】RNAinterference;Smad3;Lentivirus【摘 要】目的:构建Smad3基因RNAi慢病毒载体.方法:针对已经筛选
6、确定的Smad3基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSmad3慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用GC-shSmad3、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR和测序证实,成功构建Smad3shRNA的慢病毒载体GC-shSmad3.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×108TU/ml.结论
7、:成功构建人Smad3基因RNAi慢病毒载体. 【关键词】RNA干扰;Smad3;慢病毒转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)具有多种生物学功能,并参与多种病理生理过程,尤其是在其肌损伤-纤维化的发生发展中起关键作用。Smads蛋白是TGF-β信号的细胞内转导因子。Smad3在TGF-β-smad信号转导通路中发挥了重要作用[1]。研究发现干扰Smad3的表达是抑制组织、细胞纤维化的有效途径[2]。本研究选择慢病毒表达系统,采用基因直接克隆连接的方法,构建表达Smad3si
8、RNA的慢病毒载体，通过病毒包装产生重组病毒并扩增、感染细胞,为后期研究Smad3基因在TGF-β-smad信号转导通路中的作用机制打下基础。1 材料和方法1.1 材料 慢病毒包装细胞293T购自中国科学院细胞研究所，慢病毒包装系统由pGCSIL-GFP,pHelper1.0,pHelper2.0质粒组
