细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）.doc

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1、细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）GK4003-10GK4003-20GK4003-50GK4003-100一.试剂盒组成ComponentsGK4003-1010PrepsGK4003-2020PrepsGK4003-5050PrepsGK4003-100100PrepsGenCleanColumn2.0-mlCollectionTubeDigestionSolution(a)NPBSolutionAW1Solution(b)AW2Solution(c)AEBuffer(d)TE(pH8.0)BoiledRN

2、aseAProteinaseK(f)Lysozyme(g)SPBufferprotocol10104ml1ml6ml3ml3ml2ml50µl30µl5mg1.0ml1202010ml2ml12ml8ml8ml4ml240µl250µl15mg1.0ml1505025ml5ml30ml20ml20ml10ml480µl500µl30mg1.0ml110010050ml10ml60ml40ml40ml20ml120µl1000µl60mg1.0ml1*ProteinaseK使用前，每管加入1ml无菌水溶解，混匀，分装

3、后-20℃保存。(a)DigestionSolution低温时可能出现结晶，请于37℃温育溶解摇匀后使用，不会影响产率。(b)首次使用前，必须在AW1溶液瓶中按表示量加入无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持中的AW1乙醇含量。如果您发现AW1由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入0.6倍体积的无水乙醇。(c)首次使用前，必须在AW2瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持AW2中的乙醇含量。如果您发现AW2由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量

4、筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。(d)AEBuffer为10mMTris-HCl,0.5mMEDTApH8.5pH8.5。TE(pH8.0)或者水（pH>7.0）均可以使用，但是DNA的洗脱效率通常要低20%左右。(f)不得将ProteinaseK直接加到DigestionSolution中，以免酶失活。(g)Lysozyme使用前加入按5mg溶于100µl计算，溶于SPBuffer，溶解后，分装于-20℃冻存。客户自备：PBS缓冲液，胰蛋白酶，无水乙醇运输储存温度运输室温储存ProteinaseK,Lysozy

5、me,BoiledRNaseA:-20℃其他室温二．主要用途从细菌和各种培养细胞中小规模抽提基因组DNA。三．主要特点1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。3.快速，简捷，单个样品操作一般可在50分钟内完成。4.多次柱漂洗确保提取细菌基因组的高纯度，OD260/280nm典型的比值达1.7～1.9，长度可达50～100kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。四．培养细胞与细菌样品准备1．培

6、养细胞的准备(1)对于悬浮培养细胞：1,000g室温离心5分钟，彻底去除上清。(2)对于单层培养细胞：吸去培养基，用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞。当细胞从培养瓶表面脱落以后，将细胞转移到离心管中，1,000g室温离心5分钟，彻底去上清。(3)将离心去上清的细胞用150µlTE(pH8.0)悬浮。处理细胞可达1×106～5×107个，增加处理细胞数量，请相应增加处理时间。2．细菌样品的准备(1)将适量的指数生长期细菌（最多可达5×108细菌，约0.5ml过夜培养菌液），8,000rpm，离心1分钟，彻底弃净

7、培养基。(2)加入150µlTE(pH8.0)悬浮细菌，按照下表中的要求加入Lysozyme溶液，用吸头混匀，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌酶解时间的要求是不一样的，详见下表。革兰氏阴、阳性菌所用溶菌酶浓度与酶解时间表溶菌酶终浓度加入Lysozyme体积室温下酶解时间革兰氏阴性菌400μg/ml1μl或不加3～5分钟革兰氏阳性菌3mg/ml~8μl/150μl悬液5～10分钟五．操作步骤1.在按准备方法制备的150µlTE悬浮样品中，加入300µlDigestionSolution，混匀；加入4µlRNaseA混匀，

8、55℃保温10分钟；再加入4µlProteinaseK，55℃保温10～30分钟。注意：(1)应按次序加入，不得将ProteinaseK先加入DigestionSolution，再加到样品中。(2)保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品，55℃保温10分钟足以使细胞裂解，释放出基因组DNA。降解完全的样品应是透明液体。2.如获得的裂解液粘稠度较低，则直接添加