实验的内容、流程和注意事项

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1、实用标准文案1.酵母TAN1homologousgenes（AT1G09290（TAN1-1）：WiscDsLox393-396C14/Stock:CS854229；SALK_119543C（鉴定结果均为WT，需要再订其他突变体）熊峰已做）AT5G12410（TAN1-2）：SALK_045222.54.80.x(Stock:SALK_045222C)；SAIL_825_C11(Stock:CS836813)2.Mata1homologAT2G01430ATHB-17,HB17突变体:SALK_075942;SALK_1285603.WD40家族基因的突变体实验内容和流程：Pa

2、rtI：突变体表型：1）首先将突变体种子播种到0.5MS培养基,萌发后生长10d左右移到培养基质于温室生长2周左右。期间准备好引物.2)提取基因组DNA，用引物LP+RP和LB+RP分别进行PCR鉴定（要有对照），需要得到纯合体2-3株和杂合体2-3株。注意：不必将所有生长的植株都提取DNA进行鉴定，我们只需要纯合体2-3株和杂合体2-3株即可（将没有用拟南芥植株及早剪掉，千万不要收这种鉴定是WT植株的种子），对初步确定的杂合体和纯合体：要重复进行一次PCR鉴定.并注意有些突变体可能没有纯合体，鉴定到2-3株杂合体即可。一定要单株收种子；收种子时注意防止其它植株种子混入（将各植

3、株尽早分开）。3）纯合体：观察纯合体表型：先播种到0.5MS，移到基质于温室生长。首先确定在MS培养基上（垂直培养）和温室中植株是否和WT类似（营养生长阶段）。若突变体营养生长正常（和WT相近）：开花后10d左右观察种子败育情况；取接近成熟的、长度最长的角果进行乙醇脱水观察种子败育情况并进行统计。若突变体植株比WT矮小，则不必观察突变体以上所列的种子发育情况，只需照张照片保存。注意一定要同时播种真正的WT材料作为对照。4）杂合体，选取单株收种子的1株杂合体植株的种子（100粒左右），播种在0.5MS培养基上，待小苗长出子叶（2周左右）后提取DNA，PCR鉴定基因型，统计纯合体:

4、杂合体:WT分离比（不符合孟德尔定律的，作为我们的研究对象进行下一步实验）。注意：不必移苗到温室生长。PartII：基因表达模式和亚细胞定位1）构建基因启动子:GUS表达载体，转化野生型拟南芥。收到的种子经抗生素筛选、PCR鉴定得到转基因株系，选3个转基因株系进行GUS染色，研究其时空表达模式。2)构建基因启动子:基因--GFP表达载体，转化相应的突变体。收到的种子经抗生素筛选、PCR鉴定得到转基因株系，观察GFP荧光在细胞内的分布确定该蛋白的亚细胞定位。精彩文档实用标准文案突变体基因型鉴定流程1.核实突变体引物序列，插入位点、方向信息：举例：1）At2g19540SALK_0

5、14373正向插入插入位点：NO9intron（http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress）Isectprimers：找到引物序列LPGTGTCTCTTGGGCAGATTCTGRPGGTTTTTCTGGAGAGAATCGG2）找到插入位点、序列http://www.arabidopsis.org，核实引物序列，插入位点等信息NO5exonGTTCGAAGGGTTGCTCACCATGGATGTGTTAACCGTATACGTGCAATGCCACAAAACTCTCATATCTGTGTCTCTTGGGCAGATTCTGGTCATGTACAGgt

6、aagattatatttttgtctactttcacagcttgggtgtctttttttgtatgtgtctttgttaatgtggattagcttttgtgtttcttgacagGTCTGGGACATGAGCTCTCATCTTAATGCTTTAGCCGAATCAGAAACAGAGGGTAAAGATGGAACTTCACCGGTTCTTAACCAAGCACCCTTGGTTAACTTTTCTGGTCACAAAGATGAAGGCTATGCTATAGACTGGAGTCCTGCAACCGCTGGAAGACTTCTTTCCGgtatagttatctcagaaatttctgcgatacta

7、aataattacatgcttttcggcatggtcaatgtaatttttttttctccactggctagGGGACTGCAAGAGTATGATTCACCTGTGGGAGCCAGCTTCTGGTTCATGGGCTGTTGATCCTATTCCGTTCGCTGGACACACTGCAAGTGTTGAAGATTTACAAgtaaaactgccactttacagctaaataatatgtttgcttgtaccatttccttttggctgaacaatctgtttctttattccag精彩文档实用