应用rnai技术沉默nf-κb基因的实验性研究

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1、应用RNAi技术沉默NF．xB基因的实验性研究摘要目的设计并筛选到针对NF—rB／p65(relA)的RNA干扰的最有效靶点。构建重组腺病毒，感染小鼠成肌细胞并表达设计的siRNA，通过RNA干扰(RNAinterference，RNAi)作用，沉默NF．rB／p65基因，抑制NF-rB／p65的表达。探讨对致炎因子生成的影响，为进一步研究实验性类风湿性关节炎提供理论依据。方法根据Ambion公司提供的软件，按照RNAi的设计原则，设计3个NF—xB／p65的干扰靶点，并据设计相应的短发夹结构的RNA(sh

2、orthairpinRNA，shRNA)合成相应RNA的DNA模板，通过T4连接酶，将这些DNA分别插入shuttlevector1．0CMV质粒中形成3种重组质粒。用脂质体法将重组质粒分别转染入小鼠成肌细胞(C2C12)。通过RT-PCR方法比较各mRNA的转录水平，进而筛选出沉默效果最好的表达质粒。用所选出的重组质粒与腺病毒骨架(AdenovirallacZBackbone)线性化后共转染293细胞得到重组腺病毒。用重组腺病毒感染C2C12细胞检测其感染的效果。结果shRNA的DNA模板成功插入到shu

3、ttlevector1．0CMV表达质粒，形成重组质粒，重组质粒转入C2C12细胞并筛选出沉默效果最好的质粒。筛选出的重组质粒与腺病毒共转染293细胞构建了重组腺病毒。重组腺病毒感染了C2C12细胞。结论设计的shRNA的DNA模板可以插入到shuttlevector1．0CMV表达质粒，形成重组质粒，重组质粒可由脂质体法转入C2C12细胞，并能够有效的抑制C2C12的NF．KB／p65的mRNA的表达。关键词类风湿性关节炎(RA)；RNAi；重组质粒；重组腺病毒；基因治疗；成肌细胞(C2C12)Inhib

4、itionofNF—KBgeneexpressionbyRNAinterferenceAbstractobjectiveToinhibittheexpressionofNF-rd3／p65genebyRNAinterference，theNF-r,B／p65targetsofRNAinterferenceweredesignedandselected，andtherecombinantadenoviruswiththeselectedplasmidwasconstructed．Thenweplantores

5、earchtheeffectofinflammationfactorsandsomecellfactorsbythisRNAiinvitro．Wehopetakesomemechanismoftherapy．RA．MethodsThe3targetsofNF·1cEI／p65andcontrolsequenceweredesignedinthewebofAmbioncorporationaccordingtotheruleofdesignsiRNA．AndtheplasmidsShuttleVector1．

6、0-CMVwiththedesignsequencesofNF—r．B／p65wererecombined．SotherecombinantplasmidcanexpresstheshRNAofNF-r．B／p65．AftertherecombinantplasmidtransfectedtheC2C12cellsbyliposome，RT-PCRassaywasusedtodeterminethemRNAexpressionofNF—r．B／p65．whichcanhelptoselectaplasmid

7、withthemosteffectiveRNAi．TherecombinantadenoviruswiththeselectedplasmidandthecontrolplasmidwereconstructedandinfectedtheC2C12cells．ResultsTherecombinantplasmidsofshuttlevector1．0CMVexpressingshRNAtargetingNF—r,B／p65havebeenconstructed．andtheonewiththemoste

8、ffectiveRNAihasbeenselectedbymeansofRT-PCR．Therecombinantadenoviruswiththeselectedplasmidhasbeenconstructed，whichcanexpresstheshRNAtargetingNF—KB／p65．ConclusionTherecombinantplasmidexpressingtheshRNAtargeting