应用rnai技术沉默nf-κb基因的实验性研究

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时间:2018-12-15

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1、应用RNAi技术沉默NF.xB基因的实验性研究摘要目的设计并筛选到针对NF—rB/p65(relA)的RNA干扰的最有效靶点。构建重组腺病毒,感染小鼠成肌细胞并表达设计的siRNA,通过RNA干扰(RNAinterference,RNAi)作用,沉默NF.rB/p65基因,抑制NF-rB/p65的表达。探讨对致炎因子生成的影响,为进一步研究实验性类风湿性关节炎提供理论依据。方法根据Ambion公司提供的软件,按照RNAi的设计原则,设计3个NF—xB/p65的干扰靶点,并据设计相应的短发夹结构的RNA(sh

2、orthairpinRNA,shRNA)合成相应RNA的DNA模板,通过T4连接酶,将这些DNA分别插入shuttlevector1.0CMV质粒中形成3种重组质粒。用脂质体法将重组质粒分别转染入小鼠成肌细胞(C2C12)。通过RT-PCR方法比较各mRNA的转录水平,进而筛选出沉默效果最好的表达质粒。用所选出的重组质粒与腺病毒骨架(AdenovirallacZBackbone)线性化后共转染293细胞得到重组腺病毒。用重组腺病毒感染C2C12细胞检测其感染的效果。结果shRNA的DNA模板成功插入到shu

3、ttlevector1.0CMV表达质粒,形成重组质粒,重组质粒转入C2C12细胞并筛选出沉默效果最好的质粒。筛选出的重组质粒与腺病毒共转染293细胞构建了重组腺病毒。重组腺病毒感染了C2C12细胞。结论设计的shRNA的DNA模板可以插入到shuttlevector1.0CMV表达质粒,形成重组质粒,重组质粒可由脂质体法转入C2C12细胞,并能够有效的抑制C2C12的NF.KB/p65的mRNA的表达。关键词类风湿性关节炎(RA);RNAi;重组质粒;重组腺病毒;基因治疗;成肌细胞(C2C12)Inhib

4、itionofNF—KBgeneexpressionbyRNAinterferenceAbstractobjectiveToinhibittheexpressionofNF-rd3/p65genebyRNAinterference,theNF-r,B/p65targetsofRNAinterferenceweredesignedandselected,andtherecombinantadenoviruswiththeselectedplasmidwasconstructed.Thenweplantores

5、earchtheeffectofinflammationfactorsandsomecellfactorsbythisRNAiinvitro.Wehopetakesomemechanismoftherapy.RA.MethodsThe3targetsofNF·1cEI/p65andcontrolsequenceweredesignedinthewebofAmbioncorporationaccordingtotheruleofdesignsiRNA.AndtheplasmidsShuttleVector1.

6、0-CMVwiththedesignsequencesofNF—r.B/p65wererecombined.SotherecombinantplasmidcanexpresstheshRNAofNF-r.B/p65.AftertherecombinantplasmidtransfectedtheC2C12cellsbyliposome,RT-PCRassaywasusedtodeterminethemRNAexpressionofNF—r.B/p65.whichcanhelptoselectaplasmid

7、withthemosteffectiveRNAi.TherecombinantadenoviruswiththeselectedplasmidandthecontrolplasmidwereconstructedandinfectedtheC2C12cells.ResultsTherecombinantplasmidsofshuttlevector1.0CMVexpressingshRNAtargetingNF—r,B/p65havebeenconstructed.andtheonewiththemoste

8、ffectiveRNAihasbeenselectedbymeansofRT-PCR.Therecombinantadenoviruswiththeselectedplasmidhasbeenconstructed,whichcanexpresstheshRNAtargetingNF—KB/p65.ConclusionTherecombinantplasmidexpressingtheshRNAtargeting

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