第一节基因工程概述

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1、笫一节基因工程概述基因丄程的实验步骤pSClOl质粒我体严紧型复制控制，1〜2个拷贝.多个限制性核酸内切酶的平.克隆位点四环素抗性的强选择记号A外来DNA片段（目的基因）与载体（质粒、噬菌体或病毒）的共价连接第二节基因工程工具酶（EnzymesinGeneEngineering）限制酶和DNA甲基化酶分子克隆中常用的其他酶：DNA聚合酶依赖于DNA的RNA聚合酶连接酶核酸酶限制与修饰系统的种类DNA的甲基化作用1.Dam甲基化酶此酶可在5i_GATC3厂序列$的腺嘿_呤炉位置上引入甲基，一些限制酶Bamll

2、l、BglH>等的识别位点内含宥5厂GATC3厂。另一些限制酶的识别位点也有一部分含宥5厂GATC3厂。2.dac甲基化酶____此酶在序列_CCAGG3i_或5厂CCTGG3厂中的胞嘧啶C5位賈上引入甲基。II类限制酶识别序列的结构三、酶切反应条件人部分II型核酸内W酶需要的反应的条件丁ris-HCI50mMpH7.5MgCI210mM0-50mM低盐酶NaCI0-150mM100mM中盐酶DTT1mM150mM高盐酶Volume20-1OOulT°C37°CTime1-1.5h11型酶联合酶解A将产生的

3、5‘突出末端补平后，连接可产生新的酶切位点DNA物理图谱的绘制通过缩短酶切时间，或降低反应的温度约朿酶的活性，进行局部消化。•构建基因组文库用限制酶将基因组DNA消化为一定大小的片段，再与载体连接。•重组子的筛选鉴定用相应内切酶消化重组载体，电泳可检测插入片段的大小，和插入方向。分子克隆中的其他酶DNA连接酶(DNALigase)连接酶的分类与特性：用于将两段DNA拼接起来的酶叫连接酶。分子克隆屮最常用的连接酶巾T4噬歯体编码。未受感染的大肠杆菌中还有一种用途较窄的连接酶。这两种酶主要作用于5厂端带磷酸基团

4、的DNA底物。TaqDNA连接g每•双链DNA的切口(nick)•作用在45〜65°C,需NAD+•反应底物黏端、切口DNAT4菌体RNA连接酶__T4噬菌体RNA连接酶催化单链DNA或RNA的5i_-磷酸与另一单链DNA或RXA的3i_-羟基之间的共价连接。•催化ssDNA/RNA之间的连接2、连接酶的反应条件DNA聚合酶(DNAPolymerase)这些酶的作用大多需要模板，合成产物的序列则与摸板互补，分子克隆的许多步骤都涉及在DNA聚合酶的催化下的DNA的体外合成反应。1、DNA聚合酶1的活性(1)聚

5、合反应：目前己知两种基本的DNA合成类型：■半保留复制合成两条新的DNA链聚合反应的条件：核酸酶__■BAL31主要活性力3厂外切核酸酶活性。它可从线状DNA两条链的3厂端去除单核苷酸。BAL31还足一个内切核酸酶，因此利用其3厂外切核酸酶活性连续去除3厂端单核ft酸后形成的单链DNA,可被BAL31的内切核酸酶活性所降解。笫三节基因工程载体一载体概述■载体iaia将外源DNA携带入宿主细胞的DNA分子。■DNADNARNA载体的功能•运送外源基因髙效转入受体细胞•为外源基因提供复制能力或整合能力•为外源基

6、因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件1.具冇针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)2.具冇与特定受体细胞相适应的复制位点或整介位点1.具冇较高的外源DNA的载装能力2.具宥多种单一的核酸内切酶识别切割位点3.具冇合适的筛选标记基因克隆载体的种类■质粒(plasmid)■噬菌体或病毒DNA■考斯质粒(cosmid)与噬菌粒■人造染色体载体(4)质粒载体的选择标记■细菌接受质粒后，耍鉴定这些转化体，就需要利用质粒编码的可选择标记。这些标记可产生一种新的表型，因此可以把转化成功的细菌轻而易举地挑选出来。

7、■最常用的选择性标记是抗生素抗性基因。二、质粒的选择标记及其工作原理1.抗生素抗性基因■氨节青霉素抗性(ampicillinresistancegene,unip)■四环素抗性(tetracyclineresistancegene,tetr)■氯霉素抗性(chloramphenicolresistancegene,Cm',cat)■卡那霉素抗性(kanamycintesistancegene,kan?)■新生霉素抗性(neomycinresistancegene,neo)2.遗传标记基因■a-互补：许多载体

8、(PUC系列)都带有大肠杆菌DNA的短区段，其屮含有半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和头146氨基酸的编码信息。这种载体适用于可编码P-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，这样，lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的P-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种互补现象叫a-互补。载体：含有半乳g苷酶基因lacZ的凋控序列和头146个aa的编码序列宿主：缺失了UcZi_基因，可编码P