流式细胞仪分析技术及应用教学

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1、第十七章流式细胞仪分析技术及应用第一节概述一、工作原理二、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中的应用六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应用思考题小结流式细胞术(

2、flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。第一节概述细胞

3、组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。一、工作原理（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构：由样本和鞘液组成待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单抗对其染色受清洁气体压力

4、从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管激光光源：气冷式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）（2）光学系统FlowT

5、ipLaserSSandFLDetectorFSDetector光学系统示意图主要由计算机及其软件组成（3）数据处理系统基本工作原理单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜×物镜、光学放大统计计算机，>5000人工，200结果多参数，综合分析简单，单参数流式细胞仪与

6、显微镜的区别细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。二、散射光的测定前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。FALSSensorLaser前向散射光示意图侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。FALSSensor90LSSensorLa

7、ser侧向散射光示意图测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴细胞单核细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器三、荧光测量荧光

8、染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)荧光补偿通过流式细胞仪进行细