[农业]高效液相色谱

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1、高效液相色谱技术与应用（十二）HPLC方法论证与移植方法谁研究的组成部分准确度精密度线性范围检测限定量限专属性普适性强健性样品、试剂、仪器的稳定性与系统的适用性标准准确度(Accuracy)准确度确定的三种方法：与参比标准品比较回收测定掺入空白基质中的被测物被测物的标准品加入法精密度(Precision)国际协调会(ICH)提出的精密度分三种类型：重复性重复性为一种方法在相同的操作条件下短时间内的精密度。其中一个方面为仪器精密度，通过依次重复进样分析同一均匀样品10以上，并平均面积或峰高值，以确定全部进样的相对标准(RSD)，可

2、测该精密度。另一方面为分析内精密度，包括同一分析人员在同一条件下，对同一样品的多次测定中间精密度指在同一实验室内多次使用同一方法时，全部测定结果的一致性。包括不同日期、仪器或被测物的全分析，也包括多次配制的样品和标准品。重现性检验实验室间的精密度，往往在协作研究或方法移植实验中进行测定。线性(Linearity)方法的线性是衡量响应值与浓度的校正曲线近似为一条直线的程度。大多数方法，尤其是定量分析主成分时，其线性相关系数大于0.999既可。范围(Range)方法的范围可定义为分析方法有足够的准确度、精密度和线性的最高和最低浓度。

3、浓度的范围应包括所测样品的期望值。在目标的50、75、100、125与150%进行研究是好策略。检测限和定量限(LimitofDetection&LimitofQuantitation)一个方法有两个重要特性：检测限(LOD)和定量限(LOQ)。在方法论证期间测得的LOD和LOQ值受分离条件的影响：色谱柱、试剂，尤其是仪器设备与数据系统。专属性(Specificity)专属性为大多数分析方法中最重要指示，可定义为在其它样品物质存在的条件下可准确测定被测物浓度的能力。测定方法专属性能用两种方法：测试所有可能的干扰化合物以证明它们都

4、能与检测物峰分离，并达到规定的分离度。使用选择性检测器，特别是对共流出的化合物。普适性(ruggedness)方法的普适性被定义为方法在实际应用条件下运行时，其结果的重现性。包括不同的分析人员、实验室、色谱柱、仪器、化学试剂与溶剂的来源等等。强健性(Robustness)强健性定义为方法被微小的、但有意的参数改变对结果影响的承受能力。强健性最重要的方面是建立能预测分离参数变化对结果影响的方法考察方法强健性的有效方法是用统计学实验设计，同时评估多个参数。稳定性(Stability)为了得到重现性好和可靠的结果，HPLC方法中使用的

5、样品、标准品和试剂在适宜的时间内必须稳定。即使是单一样品的分析，测定系统的适用性也需10次以上的色谱操作，包括制作工作曲线的标准浓度，二次或三次地重复测定被测样品。时间与温度对试剂与溶液的稳定性都很重要选择流动相时应注意稳定性问题，特别是使用胺添加剂或特殊溶剂时色谱柱的长期稳定对方法的普适性十分关键。系统适用性(SystemSuitability)每天在样品分析之前，操作人员必须确定HPLC系统和操作步骤捅提供质量可靠的数据。系统适用性试验可定义为：为确保方法产生的结果具有可接受的准确性和精密度的实验测试一般将同一种标准溶液五次

6、重复进样分析的峰高或峰面积的RSD作为标准之一一主成分的定量分析，其RSD值一般应小于1%。痕量分析时较高的RSD(5~15%)也可接受。论证结果和最终方法的文件形成任何方法论证的一个重要内容是将论证实验以有适当的结论编制成文件。可采取备忘录、简报或更正式的书面记录形式。实验室间的交叉研究(可移植性)测定等同性，一般利用统计学进行检验：t-检验：比较两次实验的平均结果或确定一样本均值是否存在差异F-检验：比较两次研究的差异方差分析(ANOVA)：比较两组以上的数据，如进行同一测试的多个实验室间的比较Q-检验：评估统计学等同性通常

7、通过比较置信度水平为95%的数据。在进行这类分析和比较时，数据偶尔会超出可接受的数值范围。这时可适宜地利用Q-检验。方法论证方案方法论证方案b.任何一组的6次测定结果的计算精密度(SD)均小于等于3%。稳定性：15.样品稳定性16.试剂稳定性普适性：17.当系统地改变操作条件时，分析基质中药物的标准品溶液。强健性：应作出有代表性的色谱图