临床基因扩增检验操作规范

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1、临床基因扩增检验操作规范浙江省基因诊断中心浙江大学医学院附属儿童医院尚世强一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能规范化设置：要求参照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。1.四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。2.明确的标记，如加样器或试剂等。3.单一方向顺序，从试剂贮存和准备区

2、、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。4.使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。5.实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。6.各自的清洁用具。各室功能：（一）试剂贮存和准备区功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。（二）标本制备区功能：临床

3、标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。要正确使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。（三）扩增区功能：DNA或cDNA扩增。已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在

4、本区内进行。在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。（四）扩增产物分析区功能：扩增片段的测定。膜上微孔板上探针杂交方法、Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。负压条件。二、各阶段操作要求测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果

5、报告等。（一）标本的采集临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。玻璃器皿在使用前应高压处理，250°烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。（二）标本的稳定化处理DNA：不需特殊稳定化处理。RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使DNA酶和RNA酶失活。（三）标本的运送可在常温下通过邮寄

6、运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。（四）标本的贮存1.血清/血浆等—-70℃2.用于DNA测定的已纯化核酸样本—4℃3.用于RNA测定的已纯化核酸样本—-80℃4.用乙醇沉淀的核酸样本—-20℃5.GITC处理的RNA标本在室温可保存7天（五）标本的处理（核酸提取）抑制物可能来源于：标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。痰须液化处理。操作时（加裂解液

7、后充分混匀，沸水浴）注意：①离心管不能插得过低，以防进水；②水浴时不能加盖，防管盖爆开；③水浴时间须准确，10±1min；④水浴时不能走开；⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。RT-PCR操作注意：①标本必须新鲜；②做RNA标本的枪头离心管必须无菌；③冰上操作；④处理完后须立即

8、上机，不能放置；⑤注意左右手分开。（七）扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。实时荧光定量PCR在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光PCR的优点：精密度高，重复性能好。TaqMan荧光定量PCR原理探针两端分