生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等

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1、生物化学实验报告姓名：专业：院系：学号：19实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进

2、入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，

3、适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。19以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。洗脱体积与Vo及Vi

4、之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：Kd=(Ve-Vo)/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr

5、求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况：1、当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。191、当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子

6、如都能进入内部空隙，即Kd等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。2、当01时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香化合物的洗脱体积远超过理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分别为1.2,1.4和2.2。在实际工作中，对小分子物质也得

7、不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合牢固，称为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g.WR计算，此为也常有直接用小分子物质D2O,NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav代替Kd，其定义如下：已知Kd=（Ve-Vo）/Vi,Vt-Vo代替Vi,则：Kav=（Ve-Vo）/(Vt-Vo)即Va=Vo+Kav(Vt-

8、Vo)19在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logMK1和K2为常数，M为分子量，Ve也可用Ve-Vo,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt或Kav代替，与分子量