《核酸杂交技术》ppt课件

《《核酸杂交技术》ppt课件》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章核酸杂交技术目录第一节核酸分子杂交的概念一、核酸探针二、分子杂交信号检测第二节经典的核酸分子杂交技术一、固相杂交二、液相杂交目录第四节影响杂交信号检测的因素一、探针的选择二、探针的标记方法三、探针的浓度四、杂交率五、杂交温度六、杂交的严格谨性七、杂交反应时间八、杂交促进剂核酸分子杂交(molecularhybridizationofnucleicacid)核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程。核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或定量检测特异RN

2、A或DNA序列片段的有力工具。第一节核酸分子杂交的概念变性退火复性核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。2、融解温度(MeltingTemperature,Tm)定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。影响Tm的因素：（1）DNA碱基的组成G-C含量越多Tm值越高A-T含量越多Tm值越低（2）溶液的离子强度低离子强度Tm值越低高离子强度Tm值越高（3）pH值pH值5-9Tm值变化不明显pH<4,pH>11不利于氢键形成（4）变性剂干扰碱基堆积力和氢

3、键的形成3.复性变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素：DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度重点提示分子杂交：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。一、核酸探针核酸探针指能与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并能由其标记被特异性检测的核酸分子。探针的种类寡核苷酸探针基因组DNA探针cDNA探针RNA探针DNA探针（一）常用探针的种类

4、1.DNA探针最常用的核酸探针三大优点：①这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简便；②DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地被抑制；③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于放射性核素和非放射性物质标记。2.RNA探针优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性杂交较少，未杂交探针可用RNase降解，减少本底的干扰。缺点：易降解，标记方法复杂。3.寡核苷酸探针寡核苷酸探针一般由17～50个核苷酸组成。优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列；缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定，需优化杂交和洗脱条件以保证

5、寡核苷酸探针杂交的特异性。（二）探针的长度1.DNA和RNA探针DNA探针通常为400～500个碱基2.寡核苷酸探针探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性（三）核酸探针的标记1.探针标记物的选择（1）放射性标记（2）非放射性标记根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。不同标记类型探针的比较：优点缺点放射性探针可以准确定量；灵敏度高；本底低；易于除去旧探针,重新杂交新探针短半衰期的探针需临用前制备；放射性递减使探针降解；放射性物质对人体有害；费用贵非放射性探针对人体危害小；稳定，可供长时间内持续使用；检测过程快；可同时进行不同标记探针的杂交；本底较低灵敏度不如放射性探针；杂交

6、条件受报告基团的限制；重新杂交新探针比较困难2.探针标记方法的选择制备探针步骤：探针标记清除未标记的核酸探针检测探针标记效率核酸探针的标记方法(1)DNA切口平移标记法(2)DNA随机引物标记法(3)DNA的末端标记(7)RNA探针的标记(4)cDNA探针的标记(5)寡核苷酸探针的标记(6)单链DNA探针的标记随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。DNA聚合酶ⅠKlenow片段：保留5’→3’DNA聚合酶活性,弱3’→5’外切酶活性，无5’→3’外切酶活性。（1）DNA随机引物标记5′3′3′5′32P-部分标记的单链DNA片段切口原始位置切口最终位置32P-标记

7、的DNADNA聚合酶I[α-32P]-dCTP变性DNaseI，Mg2+dATP，dGTP，dTTPDNA酶Ⅰ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性。（2）DNA切口平移标记条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记5′p-HO-CpGpTpA……3′5′HO-CpGpTpA……3′T4噬菌体多核苷酸激酶[γ-32P]-ATP5′32p