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1、金属铜离子与蛋白质内容：研究的目的及意义铜与血清白蛋白铜与血红蛋白铜蛋白和铜酶研究目的及意义在真核生物体内，铜元素参与体内的许多生化反应，如作为电子传递链中的供体或受体；参与细胞内的呼吸；维持铁的代谢平衡；用于色素、神经递质的合成；作为氧化还原酶参与体内的抗氧化过程。但体内铜离子浓度过高时会产生毒性，改变细胞内的氧化还原状态；与某些氨基酸残基的侧链发生非特异反应，导致蛋白质的错误折叠；与其它物质竞争酶的活性中心，干扰酶的正常功能；产生活性氧损害机体的DNA、蛋白质和脂类物质。所以，研究铜离子与生物分子的作用有重要意义。铜与血清白蛋白血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质,它可以与许多内
2、源性或外源性化合物结合,在生命体内起着重要的储存和输运作用。血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。常以BSA(bovineserumalbumin,牛血清白蛋白)和HSA(humanserumalbumin,人血清白蛋白)为研究对象。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究，而牛血清白蛋白常常作为蛋白模型进行体外研究，如用于细胞培养，抗体载体等。BSA分子由583个氨基酸残基组成。而HSA比BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残基。荧光光谱法由于血清白蛋白
3、含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基,从而能发出荧光。在这些基团中Trp起主要作用,Tyr次之,Phe很弱可忽略，所以，一般认为蛋白质的荧光主要来自色氨酸的贡献。当金属离子与血清白蛋白结合后,可引起蛋白质或少数金属离子(稀土离子)荧光的改变,由此可进行定性、定量研究蛋白质构象的变化。常用荧光猝灭法测定金属离子与蛋白质的结合数和结合常数,用共振能量转移法测定金属离子与蛋白质分子中色氨酸残基之间的距离。荧光淬灭可以分为静态淬灭和动态淬灭。能降低荧光体发光强度的分子称为猝灭剂。基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物,且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为静态猝灭。而激发态荧光分子与猝灭
4、剂碰撞使其荧光猝灭则称为动态猝灭。图:Cu2+对BSA溶液荧光发射光谱的影响研究发现Cu2+能够明显猝灭BSA自身的特征荧光光谱,并且这种猝灭作用随着Cu2+的浓度的增大而增强。由于BSA自身的特征荧光主要是其色氨酸残基(Trp)产生的,表明随着Cu2+浓度的增加,BSA的骨架结构发生了较大变化,使Trp暴露出来,造成BSA的荧光猝灭,猝灭机理主要为静态猝灭。N-端三肽链(HSA为Asp1-Ala2-His3,BSA为Asp1-Thr2-His3)公认是Cu2+(Ⅱ)的强结合位点。通常金属离子与Asp1的α-NH:和His3的咪唑基N及2个去质子肽氮(加上轴向的Asp1的羧基)配
5、位,形成平面四边形(四方锥)构型。N-端三肽链能够结合金属离子的原因应该是在于His咪唑基N的配位能力,还有三肽链的灵活易变,可以折叠围绕金属离子形成所需的特定空间构型。铜离子与血红蛋白1.血红蛋白简介血红蛋白（Hemoglobin,简称Hb）在体内担任的功能是输送氧气，它能把从肺携带的氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。血红蛋白化学式为C3032H4816O812N780S8Fe4其分子量约为64500，是含有4个肽链的四聚体。它是由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成。肽链在
6、生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位上一个组氨酸残基中的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合。血红素与血红蛋白结构当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。血红素与它周围的疏水性氨基酸残基依靠范德华力保持确定的空间构象。铜离子与血红蛋白相互作用血红蛋白在280nm附近有一个吸收峰，这是由于蛋白质中芳香族氨基酸共轭键的紫外
7、吸收所致，在400nm附近有一个索瑞(soret)吸收峰，这是血红素卟啉环的π~π*跃迁带，为强吸收峰。测试牛血红蛋白醋酸缓冲液在加入铜离子醋酸缓冲液前后的紫外光谱发现，在血红蛋白溶液中加入铜离子后，不论加入的铜离子浓度有多大，在280nm处的吸收峰均消失，而其400nm附近的强吸收峰则随着铜离子浓度的增大降低越来越明显(下图左)，表明铜离子浓度越大，对蛋白质π~π*跃迁带的破坏性越大。左：2μmol/L血红蛋白与不同浓度铜离子反应分钟后的紫外光谱图右：血红蛋白与铜离子相互作用时
