大鼠灌注固定取脑,解剖取材ppt课件

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1、大鼠灌注固定取脑主讲：陈爽2017.9.12用途1.用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于westernblot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体，准确检测其表达的位置和量。必要性1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较

2、为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响流程麻醉开胸心尖向左心室穿针剪开右心耳生理盐水冲洗4%多基甲醛固定取脑保存或切片.具体过程大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定,切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲

3、液配法：称取40gPFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500mlPBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。也可用10%福尔马林溶液，甲醛1

4、：10稀释甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠6.5g蒸馏水900ml或甲醛100ml加900mlPBS缓冲液。2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用止血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至

5、流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好省时省剂的方法夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬大鼠脑组织取材步骤1.剪开皮肤2.用钩镊再眼眶处固定大鼠颅

6、骨，用组织剪再颅骨和颈椎连接处剪断3.组织剪头部伸入枕骨大孔，尽量贴着骨头（不能插太深伤到脑组织）。4.组织剪从枕骨大孔处伸入，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪，剪到眼眶5.从大鼠眼眶之间剪断6.左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨，用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头直接就掀起来了从小脑处将脑组织向上推起，用小剪刀剪断脑神经注意事项1.多聚甲醛气味刺激，配置时做好自我保护。2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏

7、，出血少。3.经心脏灌注，有时穿刺针会误进右心室，那样灌注主要在肺循环起作用，体循环的血液影响不大。所以观察将穿刺针插入到主动脉内可以确保起到体循环灌注冲洗血液的效果，脑组织的血液冲干净后，才不会影响免疫组化的效果，不然到处都是红细胞造成的背景染色。4.灌注时注意排空输液管中的气泡，不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。5.关于生理盐水的温度的选择，有人认为因为是快速冲刷血管里的血液，低温造成血管收缩，灌注的效果反而没有室温的好。但是用低温的认为，低温有利于组织完整。6.灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后

8、老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而硬。7.去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉。