SNT1390-2004香蕉细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1390-2004香蕉细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法MethodsforquarantineandidentificationofRalstoniasolanacearum(Smith)Yabuuchietalrace22004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T1390-2004月叨吕本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广州出人境检验检疫局。本标准主要起草人:张传飞、钟国强、赵立荣、司徒保禄

2、.本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1390-2004香蕉细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境植物检疫中香蕉细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法。本标准适用于香蕉、大蕉、蝎尾蕉等寄主植物之果实、吸芽、试管苗和其他繁殖材料的香蕉细菌性枯萎病菌检疫鉴定。2规茫性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款二凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GS/丁4789.28-1994食品卫

3、牛微生物学检验染色法、培养基和试剂3原理香蕉细菌性枯萎病菌的分类地位学名Ralstuniasulanacearum(Smith)`iabuuchietalrace2异名Pseudomonassolanacea，二二E.F.Smithrace2,病害英文名Mokodiseaseofbanana或者Aacteriaiwiltofbanana。该病菌隶属于原核生物界Procaryotes，薄壁细菌门Gracilicutes,Ralstoniacea。科，尺alstonia属。香蕉细菌性枯萎病菌在寄主范围、症状特点、培养性状及生物学特性等方面，不同于近似种，也不同于青枯菌的其他生

4、理小种或生物型，是该病菌的鉴定依据(参见附录八、附录B),4仪器和试剂41仪器、器具4.1.1生物显微镜。4，2体视显微镜。413超净工作台。414生物培养箱。415高压灭菌器。4，1.6恒温干燥箱。4，.7电冰箱。4.1.8普通天平(感量0.01g),4.1.9试管(15mmX130mm)。4.1卜10小件用器具;培养皿、酒精灯、试管、载玻片、盖玻片、接种针、接种环、移液器、白瓷盘、烧杯、记号笔、小剪刀、镊子、刀片等。42试荆4.2.1TTC培养基(参见附录C)o4.2.295%乙醇(C2H,0)。4,2.3次氯酸钠溶液(NaC10)e42，4无菌水。aSN/T1390

5、-20045实验室检验5.1症状检查首先应看植株是否萎蔫，检查植株的根茎叶果等各个部位，叶片是否变黄、折挂，果实是否质地变硬、颜色变褐、干腐。如果发现上述任何一种症状，应及时用解剖刀横向剖开病株假茎基部，检查其维管束组织是否变褐色、病部受挤压后是否有菌脓溢出，如果是则应进一步分离纯化菌种。本病症状易与香蕉巴拿马萎蔫病(Fusariumoxysporiumf.sp.cubensis)混淆，但前者通常是植株上部的三片幼叶先褪绿黄化，而后者往往是下部老叶先发病、病部无菌脓、为害不产生褐色干腐的病果.5.2细菌的分离纯化5.2.1分离:采用选择性TTC培养基，用平板划线法或稀释分

6、离法分离细菌。将病组织切成3mm见方的小块，先用70%乙醇浸泡30s，捞出后用0.3%次氯酸钠溶液处理5min，再用无菌水清洗两次，最后把病组织置放在洁净的载玻片上捣碎，静置20s，用接种环蘸取汁液在TTC平板上划线，350C-370C下培养2d--4d后，检查并筛选培养基上的菌落。青枯菌在TTC上特征:无致病力或致病力很弱的菌落为深红色，致病性菌落为流质状、白色或中央带淡红的白色。5.2.2菌种纯化:采用平板划线法，即用灭菌的移种针针头蘸取TTC上可疑的致病性菌落后，在TTC平板上多次划线纯化，在350C-370C温度下培养2d-4d，移出单个菌落后进一步扩大繁殖。5.

7、3革兰氏染色反应(可省略本步骤)革兰氏阴性反应，按GB/T4789.28-1994中的2.2进行实验5，4致病性测试5.4.1测试植物测试植物除香蕉外，还应在马铃薯、番茄、烟草、茄子、姜五种植物中任选两种。香蕉枯萎病菌属于2号小种，寄生专化性强，只为害香蕉不为害其他测试植物。5.4.2接种方法接种采用针刺加注射的方法，用消毒的挑针蘸上菌龄为24h、浓度为10'cfu/mL的细菌悬浮液后，针刺植株的上部幼叶或(假)茎基部。注射法采用注射器在每株植物的茎基部注射10mL左右的接种液，接种浓度10'cfu/mL。阴性对照用无菌水代替