论文：氨基酸直接分析法原理及应用

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1、氨基酸直接分析法原理及应用丁永胜牟世芬中国科学院生态环境研究中心,Dionex中国有限公司应用研究中心北京100085提要本文介绍一种新型氨基酸分析方法—离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPIC-IPAD)，详细讨论方法的原理和应用，该方法与传统方法比较，无须进行柱后或柱前衍生反应，可以对氨基酸直接进行分析，灵敏度高，大多数氨基酸的最小检测限均小于1pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。关键词：氨基酸，离子交换色谱-积分脉冲安培法1前言目前，氨基酸分析方法主要有两种类型：1）阳离子交换分离,茚三酮（Ninhydr

2、in）或邻苯二甲醛（OPA）柱后衍生反应，分光光度法或荧光法检测[1]；2）反相色谱分离，柱前衍生，荧光检测，常用的衍生试剂有AQC(6-aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl-carbamate)，FMOC(9-fluorenylmethylchloroformate)，Dabsyl(4-di-methylamino-azobenzenesulfonylchloride)，Dansyl等。这些方法的缺点是操作繁琐，氨基酸衍生物不稳定，衍生反应的副产物和试剂本身的干扰及衍生试剂昂贵

3、等[2]。本文介绍Dionex公司新近推出的氨基酸直接分析仪是基于阴离子交换分离机理，积分脉冲安培法检测，无需衍生反应。2方法原理2.1阴离子交换分离迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。这些氨基酸的基本结构通式如下：HR—C—COO-NH3+氨基酸具有两性离子结构，在酸性介质中，以氨基阳离子状态存在；在碱性介质中，以羧基阴离子状态存在，这也是氨基酸分离分析方法的基础。阴离子交换树脂含有的碱性基团-N(CH3)3OH（强碱型）或-NH3OH（弱碱型）可以解

4、离出OH-，能和溶液中的氨基酸阴离子发生交换。氨基酸与树脂的亲和力，主要取决于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧连与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用和氨基酸的空间构型。在pH12~13，氨基酸与阴离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是酸性氨基酸>中性氨基酸>碱性氨基酸,因此氨基酸的洗脱顺序大体是碱性氨基酸,中性氨基酸和酸性氨基酸。氨基酸的全部洗脱顺序如图1所示。流动相由纯水、0.25MNaOH和1.0MNaAC三种常见的溶液组成，表1列出了分析氨基酸的典型梯度淋洗条件[3]。其中氢氧化钠不仅提供淋洗离子OH-，而

5、且碱性pH条件也是氨基酸在金电极表面进行氧化反应，实现积分脉冲安培检测的必须条件。醋酸根离子（Ac-）对固定相的亲和力大于OH-，具有较强的洗脱能力，对于保留较强的氨基酸起“推”的作用。表1氨基酸分析的典型梯度淋洗条件Table1　Typical　GradientConditionsForAnalyzingAminoAcidinHydrolysates时间Time（min）E1E2E3备注（流速：0.25mL/min）初始0.002.008.0011.0018.0021.0023.0042.0042.1044.10

6、44.2075.00767676646440441414202076762424243636201616168080242400000404070700000装样阀切换进样开始OH-梯度淋洗,阀复位开始醋酸钠梯度用高浓度氢氧化钠冲洗柱子系统开始重新平衡,恢复到初始状态注：E1=纯水，E2=0.25MNaOH，E3=1.0MNaAc2.2脉冲积分安培检测在pH12~13溶液中，在金工作电极和pH-Ag/AgCl参比电极之间施加一个较高的电位，α-氨基酸在金电极表面被氧化，大多数氨基酸开始先被氧化为亚胺（1），然后进一

7、步氧化为腈基化合物（2），另外，少量的亚胺发生水解生成醛类化合物（3）。反应过程如下[4]：（1）R-CH(NH2)COO-→R-CH=NH+H++2e-（2）R-CH=NH→R-CN+H++2e-（3）R-CH=NH+H2O→R-CHO+NH3氨基酸的脂肪侧链抑制氨基酸的氧化反应（如亮氨酸和异亮氨酸），而氨基酸侧链中的羟基（丝氨酸和苏氨酸）、酰胺基（天门冬氨酸）和咪唑基（组氨酸）有利于这些氨基酸的氧化反应。在金电极上得到氨基的最大氧化电流所需的电位超过金表面氧化的电位，在高电位时，金电极本身形成表面氧化层和氨基酸

8、氧化产物的附着，金电极会很快失效。金电极表面氧化时所产生的电流无疑会增加背景和基线噪音以及基线的不稳定性。为了增加氨基氧化时所产生的检测信号，抑制金电极氧化所产生的背景信号，1989年Johnson等人[5]引入了一个新的技术—积分脉冲安培。与脉冲安培相似，积分脉冲安培法中加到工作电极上的也是一种自动重复的电位对时间的脉冲电位波形，其不同之处是采样时的电位不