电镜观察血小板样品制备

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1、材料和方法家族史目前的研究对父母的鉴定先前已经报道过。他们3个儿子中的2个身体健康，另外一个死于消化道溃疡引起的出血。他们的女儿没有症状，但是她的儿子，像她的两个兄弟一样血小板减少，微小创伤后容易出血。受累及的成员的血小板计数从20000－30000/ul，平均血小板体积为10－25fl或者更大。关于他们X连锁GATA－1基因缺乏的具体情况在先前研究中已经详细的报道过。制备血小板目前研究的血样来自前往Mayo诊所就诊的一个家庭成员，随后来自他及其家属的血样被从芝加哥快递至实验室。在给他们抽血前，我们的研究已经获得了他们的知情同意。父母和正常的对照组在静脉抽血前至少10

2、天都没有口服阿司匹林或者含有阿司匹林的药物。取到的血样立即和PH6.5的枸橼酸葡萄糖混合，血样与抗凝剂的比例为9：1。部分血样与100mmol/L的EDTA以同样的比例混合。富含血小板的血浆（PRP）在室温下转速100g离心分离20分钟。固定将血样与怀特式盐（White'ssaline)中等量的0.1%的戊二醛混合，这样悬浮血小板的固定就完成了。（White'ssaline：将以下两种混合物按1：1混合后的10%溶液：（1）2.4mmol/LNaCl，0.1mmol/LKCH，46mmol/LMgSO4和64mmol/LCa（NO3）2－4H2O；（2）0.136mo

3、l/LNaHCO3，8.4mmol/LNaH2PO4和0.1g/L酚红，PH7.4)15分钟后血样离心至团块状，在同样的缓冲液中用3%的戊二醛冲洗混匀。吹打混匀在4℃保持30分钟，然后沉淀至团块状。弃去上清液，注入Zetterquist's缓冲液中的1%的锇酸或者含有1.5%氰亚铁酸钾的蒸馏水中1%的锇酸在4℃保持1小时。所有的样本有一系列梯度的乙醇干燥脱水，且由环氧树脂812包埋。由超薄切片机从树脂块上切下的超薄切片直接在电镜下观察或者由醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色以增强对照后观察。本实验观察所用仪器为飞利浦301电镜。全量血小板的制备小滴的PRP置于聚乙烯醇缩甲醛包被

4、的碳固定的网格上，10－15秒内用蒸馏水冲洗，用滤纸从边缘干燥，在空气中晃动以去除残留的水分。无需固定或者染色将网格子插入电镜观察。