微生物常规鉴定技术

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1、微生物常规鉴定技术一、微生物检验中常用的生化反应１、糖发酵试验　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0℃培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，固体培养基则出现裂隙,有时还可看出接种菌有无动

2、力，若有动力、培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和Andrade指示剂。糖发酵试验是鉴定细菌最常见的生化反应,特别是肠杆菌科细菌的鉴定.2、甲基红（MethylRed）试验　　肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

3、　　试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1℃或30℃（以30℃较好）3～5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4～6.0，其pH值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。3、V-P试验　　某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养

4、基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。　　试验方法：　　①O’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1℃培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有0.3％肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40％5氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1～2min，静置于室温或36±1℃恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48～50℃水浴放置2h后判定结果者。

5、　　②Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1℃培养4天、培养液2.5ml先加入5％α萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40％氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1℃恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。③快速法：将0.5％肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5％α-萘酚3滴，40％氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能

6、使用。本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。产气肠杆菌和大肠埃希氏,前者VP试验阳性,后者VP试验阴性。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。4、靛基质（Imdole）试验（又称为吲哚试验）　　某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。　　试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1℃培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2

7、～3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。　　实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。5、硝酸盐（Nitrate）还原试验　　有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。　　试验方法：临试前将试剂

8、的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。　　用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。α-萘胺具有致癌性，故使用时应加注意。6、明胶（Gelatin）液化试验　　有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋