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1、产酸克氏杆菌1,３丙二醇发酵液中2,３丁二醇的定性和定量分析【摘要】产酸克氏杆菌（Klebsiellaoxytoca）在厌氧和微好氧条件下均可以发酵甘油产生1,３丙二醇。相对于厌氧发酵液，在微好氧发酵液的高效液相色谱图中出现两个未知物峰。对微好氧发酵液进行离心，脱盐和蒸馏处理，以两未知物质为主要成分的馏分通过气相色谱质谱联机分析显示两种未知物质均为2,３丁二醇，通过气相色谱和高效液相色谱分析确定两未知物质分别为meso2,３丁二醇和Ｌ(+)２,３丁二醇。建立了用HPLC法对meso2,３丁二醇和Ｌ(+)2,３丁二醇进行外标定量的测
2、定方法，在标准品浓度100～1200mg/L范围内，meso2,３丁二醇线性方程为y=7×１0－6x，r=0.999１；Ｌ(+)2,３丁二醇线性方程为y=7×１0－6x，r=09998。在发酵液样品中meso2,３丁二醇的回收率为9967％；相对标准偏差RSD为0.35％，Ｌ(+)2,３丁二醇的回收率为9989％；相对标准偏差RSD为0.09％。【关键词】2,３丁二醇，定性分析，定量分析，高效液相色谱，产酸克氏杆菌1引言1,３丙二醇和2,３丁二醇均为重要的化工原料，具有很好的应用前景。1,３丙二醇可用作生产聚酯和聚氨酯的单体，
3、近年来随着对新型聚酯对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的应用开发，1,３丙二醇的需求量不断增大[1－3]。目前，1,３丙二醇工业化生产均采用化学合成法。但由于可以利用成本较低的可再生资源且不会带来严重的环境污染，用微生物发酵法生产1,３丙二醇近年来成为研究热点[1,2]。2,３丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等各个领域[4，５]。由于结构特殊，化学法合成2,３丁二醇成本很高，目前生产2,３丁二醇均采用发酵法[４]。克雷伯氏菌是用于2,３丁二醇生产的重要菌种，可以发酵葡萄糖产生meso2,３丁二醇和Ｌ(+)2,３丁二醇的混合物[６，
4、7]。在厌氧条件下，产酸克氏杆菌可以发酵甘油产生1,３丙二醇，同时产生丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇等副产物。底物甘油和这些产物均可用高效液相色谱进行分析。但用高效液相色谱分析微好氧条件下的发酵液时，除上述物质峰外还出现了两个未知物。本实验采用气质联机、气相色谱和高效液相色谱分析确定两个未知物分别为meso2,３丁二醇和Ｌ(+)2,３丁二醇，并建立了用高效液相色谱定量分析两种2,３丁二醇的方法。2实验部分2.1仪器和试剂高效液相色谱仪包括510系统和2414示差折光检测器（美国Ｗater公司）;色谱柱为BioRad公司AminexHPX87H强酸阳
5、离子交换树脂柱，柱温65℃，检测器温度45℃；流动相为0.005mol/LH2SO4，流速为0.8mL/min。分析软件：北京创新通恒科技有限公司CXTH3000色谱工作站。VECTOR33型傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司);TURBOMASSAUTOSYSTEMXL型气质联用仪(美国PerkinElmer公司)，DBWAX的30m×0.32mm石英毛细管柱；初始温度为100℃(2min)10℃/min200℃(2min)，载气为高纯氦气，流速0.8mL/min，进样口温度200℃；传输管温度220℃；EI电子源，电子能量70e
6、V；溶剂延迟3min，进样量0.2μL。检索谱库为：NIST和WILEY数据库的质谱计算机数据系统。7890F型气相色谱仪(上海天美公司)，毛细管柱(16m×0.25mm,0.33μm),柱温150℃；进样口温度180℃，FID检测器温度为180℃,灵敏度为9，衰减为0，载气为高纯氮气，流速为1.0mL/min，进样器分流比为55∶1，进样量0.5μL。分析软件：浙江大学智能分析研究所N2000数据工作站。1,３丙二醇、Ｌ(+)2,３丁二醇和meso2,３丁二醇(Aldrich公司,色谱纯）；其它试剂为分析纯。2.2样
7、品处理方法发酵液脱盐：D001×7阳离子交换树脂填充柱，用1mol/LHCl转换成H＋型；D201×7阴离子交换树脂填充柱，用1mol/L的NaOH转换成OH－型。离心后的发酵液先流过阳离子交换树脂填充柱，再流过阴离子交换树脂填充柱。发酵液在流经柱前后通过高效液相色谱分析检查其中各组分浓度变化。脱盐后发酵液在常压下置于圆底烧瓶中加热至沸腾，温度升到110℃停止，HPLC法分析组分变化。浓缩发酵液置于连有抽真空装置的简单蒸瓶中加热，分段收集馏分并用HPLC法分析馏分组成。标准品溶液制备：分别称取Ｌ(+)2,３丁二醇0.1144g和m
8、eso2,３丁二醇0.1115g，
