厌氧菌的分离鉴定

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1、厌氧菌的分离鉴定厌氧菌广泛存在于外界环境和人体的口腔、肠道和女性生殖道等部位，常引起内源性感染。据文献报道，约60%的临床感染有厌氧菌参与，且大多数是与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。一、厌氧菌样品的采集Collectionofanaerobicbacteria'sspecimens标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法：(1)脓胸及未破溃的脓肿：皮肤消毒后，以无菌注射器抽取(排尽空针及针头内的气体)，将针头插入无菌橡皮塞内送检。(2)肺分泌物和痰标本：用支气刷采

2、取或环甲膜穿刺术。(3)尿液标本：用元菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺术抽取。(4)血液标本：可用两端接有无菌针头的塑料袋或橡皮导管，将一端针头刺入静脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内(瓶内负压)，使血液直接流入培养瓶内。(5)窦道、深部脓肿等的标本:可用特别采样器采取。二、涂片与染色Smearpreparationandstain标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用"少量”"+"、"++"、"+++"、"++++"表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊

3、形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖：韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。根据厌氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报告，建议采用哪类药物。三、标本接种Inoculating一般标本接种3个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5%~l0%CO2的环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种l个厌氧血琼脂平板，也可增加1个相应

4、的选择厌氧血琼脂平板。为便于在混合培养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3段划线接种，在第1和第2段交界处贴1张甲硝哗(5mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类：1.革兰阴性杆菌(1)在BBE琼脂平板上有灰黑色、直径>lmm的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。(2)在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有砖红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。(3)菌

5、落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解脲拟杆菌和纤细拟杆菌。(4)菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。2.革兰阴性球菌菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。3.革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。4.苹兰阳性无芽胞杆菌(1)菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。(2)菌体呈X、Y、V排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。5.革兰阳性芽胞杆菌只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。菌落有双环溶血，卵

6、黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagler试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。四、耐氧试验Oxygentolerancetest当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。从每个琼脂平板上挑取4~5个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2块需氧血琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4~6区，每区种一个可疑菌落)，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌(图3-48中

7、A区);在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌(图3-48中B区);在需氧和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌(图3-48中C区);在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌(图3-48中D区)。五、鉴定试验Identificationtest可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶

8、试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验，4h即可观察结果;自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI、MicroScan-ANI等也可鉴定厌氧细菌。在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项:①厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝(厌氧菌暴露于空气中时间太长可死亡)，务必在30min内完成，同时应避免正常菌群的污染。②培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不