nyt 556-2002 鸡传染性喉气管炎诊断技术

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1、ICS11.220B41中华人民共和国农业行业标准NY/T556-2002鸡传染性喉气管炎诊断技术Diagnostictechniquesforavianinfectiouslaryngotracheitis2002一08一27发布2002一12一01实施中华人民共和国农业部发布NY/T556-2002前言鸡传染性喉气管炎是鸡的重要疫病之一，世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAnimalHealth(英),OfficeInternationaldesEpizooties(法),OIE〕

2、将本病定为B类动物疾病，我国定为二类动物疫病。本标准主要参照OIE推荐的鸡传染性喉气管炎(OLT)诊断方法制定。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部动物检疫所。本标准主要起草人:范根成、王永玲、刘相娥、王红。NY/T556-2002鸡传染性喉气管炎诊断技术范围本标准规定了鸡传染性喉气管炎病毒分离及琼脂凝胶免疫扩散试验的技术要求。本标准规定的病毒分离技术，适用于本病的确诊。琼脂凝胶免疫扩散试验，适用于传染性喉气管炎的血

3、清学诊断及用传染性喉气管炎疫苗免疫后的抗体检测。2病毒分离鉴定技术2.1材料准备2.1.1病料的准备2.11.1活体采样:用灭菌棉拭子伸人口咽或气管采集分泌物，放人含青霉素4000IU/mL，链霉素4000pg/mL的无菌生理盐水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，处理方法同上。2.1.1.2尸体采样:无菌采取病死鸡喉头和气管，放人无菌的平皿或烧杯中，密封。2.1.2样品的运送采集的样品应立即放人4℃冰箱保存，24h内送到实验室;不能在24h内送到实验室时，应将所采样品冷冻保存和运输。2.1.3样品处理2.1.31

4、收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动、挤干棉拭子，将样品液经10000r/min离心10min，取一清液，加入青霉素4000IU/mL,链霉素4000pg/mL，于37℃作用30min，作为接种材料。2.1.3.2组织样品:无菌条件下将组织剪碎，按1:4加人生理盐水后用研磨器研磨制成20%的匀浆悬浮液，再经10000r/min离心10min，取上清液，加人青霉素4000IU/mL,链霉素4000pg/ml，于37'C作用30min，作为接种材料。2.2操作方法2.2.1样品接种取经处理过的样品，接种9.

5、12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜。每枚0.2mL，接种后的鸡胚在370C孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d，弃去24h内死亡的鸡胚，24h-120h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成;120h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。有痘斑者，取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨后，置一20'C冻存备用;无痘斑者，亦取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨，反复冻融，离心后，接种9^-12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜育传。如此盲传3代以上，如仍无病变，则判为鸡传染性喉气管

6、炎阴性。2.2.2病毒鉴定病毒分离物的鉴定:用鸡传染性喉气管炎标准阳性血清(效价在1:32以上)和标准阴性血清与分离物作鸡胚中和试验，固定血清，稀释病毒法中和试验操作方法。血清处理:将传染性喉气管炎标准阳性血清和标准阴性血清56℃灭活处理30mine病毒稀释:将病毒分离物用含青霉素1000IU/mL,链霉素1000pg/mI，的灭菌生理盐水稀释，稀释方法见表IoNY/T556-2002表，病毒分离希释方法管号病毒分离物稀释度试管中的混合液1zX10-11ML病毒分离物原液+4mL稀释液22冰10-1mL2号管

7、液+9mL稀释液32X10-'1mL3号管液+9mL稀释液42X10-ImL4号管液+9mL稀释液52又10-11mL5号管液+9mL稀释液病毒一血清混合液:设两排试验管，每排4个管，第1排每管放0.6mL标准阳性血清，第2排每管放。6mL阴性血清，然后向每排1-4号试验管内分别加人(2X10-'-2X10-)稀释的病毒悬液各。.6mL，将病毒一血清悬液混合并置冰箱(40C-8"C)4h.鸡胚接种及结果判定:取经处理过的病毒一血清混合液，分别接种9^-12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜，0.2ml,/枚，每管接种5枚，

8、接种后的鸡胚在37'C孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d，弃去24h内死亡的鸡胚，24h-120h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成;120h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。记录观察结果，按半数致死量(Reed-Muench)方法计算EID,n，计算方法见附录A(规范性附录)。2.3结果判定如分离物能引起鸡胚绒毛尿囊膜出现典型的痘斑