免疫组化幻灯精品医学ppt课件

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1、掌握免疫组化技术的概念、原理、优点、ABC染色的基本操作，了解免疫组化染色技术的其他几种方法及临床应用。学习重点主要讲述的内容概述免疫组化的概念和优点。免疫组化染色前的准备。抗体的标记如何降低非特异性染色。免疫组织化学方法免疫组化结果的判定以及染好切片的关键免疫组织化学的应用。免疫酶组织化学染色图片举例。免疫组织化学又称免疫细胞化学，其主要原理是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显

2、微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可应用相应的特异性抗体，将其用免疫细胞化学手段检出，并研究。概念1.高度的特异性抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。免疫细胞化学的突出优点是：2.敏感性高现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力

3、的抗体，保证可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。3.方法步骤统一若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。4.形态、机能和代谢密切结合是一种集定性、定位和定量密切结合；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。抗原修复常规石蜡切片的标本一般均采用甲醛固定，甲醛固定的部分组织细胞免疫组化的敏感性明显降低，主要原因为甲醛固定过程中形成的醛键以及甲醛固定导致的蛋白与蛋白之间的交联，均会封闭部分抗原决定簇，同时甲醛的这种交联作用会影响细胞

4、膜的通透性，使抗体分子难于渗入细胞内，从而影响染色效果。化学方法(酶消化方法)胰蛋白酶(trypsin)消化方法酶浓度一般为0.05%~0.1%,胃蛋白酶(pepsin〉消化方法0.4%胃蛋白酶链霉蛋白酶(poruse)消化方法浓度为0.1%。物理方法单纯加热方法;高压加热方法;微波方法微波方法将切片常规脱腊后水洗，放入盛有枸橼酸缓冲液的容器中，置微波炉加热沸腾，时间为5min×2次。加热完毕，将切片缸在室温下放置，使缸内温度自然下降至40℃左右，蒸馏水洗，进入免疫组化染色。抗体的标记为了使抗原-抗体

5、可见，必须将抗体标记，利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大，并转换成可见的荧光或呈现出颜色。免疫组化染色中比较成熟的标记物有：异硫氰酸荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白、胶体金、葡萄球菌A蛋白、生物素、放射形核素等。由于标记物和抗体结合，酶促反应的定位就间接地显示抗原-抗体反应的定位。免疫组织化学染色中的非特异性着色凡不属于特异性抗原抗体反应所呈现的染色。原因：组织方面：自发荧光、内源性过氧化物酶或碱性磷酸酶、内源性生物素等。试剂方面：抗体不纯、标记酶或荧光不纯或标记过量等。在滴加一抗前，采用非免疫动物血

6、清封闭组织中的带电集团，避免与第一抗体的非特异性结合。阻断内源性酶。如3%的H2O2等。增加第一抗体的稀释度调整孵育时间及反应温度避免染色过程中标本干枯等方法。免疫酶组织化学消除非特异性染色的几种方法免疫组化染色方法(1)免疫荧光法(2)免疫酶标法(3)免疫胶体金法免疫荧光法的基本原理将已知的抗体分子标记上荧光素，再与相应的抗原起反应，形成的抗原抗体复合物因带有荧光素，在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的免疫复合物结合部位，从而做出判断。作为病理诊断，免疫荧光法具一些不足之处,如：(1)特异性抗体用量大；(

7、2)敏感性及特异性不够理想；(3)荧光强度随时间延长而慢慢减弱；(4)需要昂贵的特殊显微镜。免疫酶组织化学方法60年代日本学者Nakane等首创建立了酶标记抗体技术检测组织中的抗原，免疫酶组织化学技术的特点：可用普通显微镜代替荧光显微镜；切片不易褪色，可长期保存；阳性细胞定位精确；组织结构清晰；可作免疫电镜超微结构观察等优点。标记抗体法不标记抗体法常用的免疫酶组织化学方法免疫酶组织化学常用的酶理想的标记酶的要求酶的活性高且稳定终产物稳定，不扩散，有良好的定位酶和抗体的结合不影响抗原和抗体的结合在组织中和体

8、液中不存在内源性的酶及其底物应用最多的标记酶辣根过氧化物酶（HRP）稳定性好，在PH3.5～12范围,60℃加热15分钟不失活穿透性强，溶解度大.底物为H2O2，DAB（3′，3-二氨基联苯胺）为供氢体,反应式为：HRP.H2O2+DH2HRP+D+2H2O碱性磷酸酶（AP）ABC三步法(亲和素-生物素-过氧化物酶连结法)ABC法是利用亲和素（卵白素）与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质,先将生物素与辣根过氧化酶（HRP）结