瘦素受体在实验性多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及

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1、瘦素受体在实验性多囊卵巢综合征大鼠卵巢中的表达及【摘要】目的研究来曲唑诱导建立多囊卵巢综合征（PCOS）动物模型中卵巢组织瘦素受体（ObR）及其mRNA的表达，探讨卵巢ObR变化与PCOS发病机制的关系。方法6周龄清洁级雌性SD大鼠45只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各15只。正常组每日自由摄取食物和水；溶剂组每日给予1％羟甲基纤维素水溶液2mL/kg灌胃；来曲唑组以来曲唑0.5mg/kg灌胃。观察大鼠体质量、动情周期、卵巢质量及其形态学改变，测定血清黄体生成素（LH）、睾酮（T）、胰岛素（INS）、瘦素（LEP）及血糖（FG）水平，采用免疫组织化学和RealTi

2、meRTPCR方法检测大鼠卵巢中ObR及其mRNA的相对表达，并对3组的各指标进行比较。结果来曲唑组大鼠体质量和卵巢质量指数升高，动情周期消失，卵巢体积增大，白膜增厚，HE染色可见较多囊状扩张的卵泡且黄体数量明显下降，血清T、LH、INS、LEP水平明显升高（P<0.05）；卵巢ObR及其mRNA表达明显增强（P<0.05）。结论来曲唑诱导建立的PCOS动物模型临床表现与人类似；卵巢中ObR表达上调，可能是导致PCOS患者不排卵、生育力下降的原因之一。【关键词】多囊卵巢综合征；卵巢；瘦素；受体，肽；疾病模型，动物多囊卵巢综合征(polycystic

3、ovarysyndrome，PCOS)是生育年龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病，以卵巢的功能紊乱为特征，常表现为不孕和肥胖，但其发病原因目前尚无定论。瘦素（leptin，LEP）是肥胖基因（ob基因）的表达产物，近年来的研究认为,LEP是营养与生殖之间的代谢信号，它在生殖方面有许多重要的调节作用[12]。研究还显示，LEP存在于卵泡液中,且LEP受体（ObR）在人卵巢中几种不同的细胞上也有表达，表明LEP能够对性腺行使直接的作用[3]。笔者通过研究PCOS大鼠卵巢中ObR及其mRNA的表达情况，探讨其与PCOS发病机制的关系，现报告如下。1材料和方法1.1PCOS动物

4、模型6周龄清洁级雌性SD大鼠，购自中国科学院上海实验动物中心[许可证号：SCXX(沪)20070005]，平均体质量180g，二级动物房饲养，恒温22℃，光照12h、黑暗12h交替，自由摄取食物和水。每日定时作阴道涂片检查，选择动情周期4～5d，连续2个正常动情周期的大鼠即开始用于实验，共选出45只，分为正常组、溶剂组和来曲唑组，各15只。来曲唑组每日给予溶解在1％羟甲基纤维素水溶液（CMC）2mL/kg的来曲唑（芙瑞，江苏恒瑞医药股份有限公司）0.5mg/kg灌胃，连续21d[45]；正常组每日自由摄取食物和水；溶剂组每日给予CMC2mL/kg灌胃。1.2大鼠体质

5、量及动情周期每日同一时间称量大鼠体质量，同时进行阴道脱落细胞涂片，瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态的变化，确定大鼠动情周期的情况。1.3大鼠血清中各项指标末次给来曲唑24h后，禁食8h，对所有大鼠进行下腔静脉取血，采用放射免疫分析法测定大鼠血清黄体生成素（LH）、睾酮（T）及胰岛素（INS）、LEP，试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，批内和批间变异系数分别<10%和<15%。血糖（FG）测定采用葡萄糖氧化酶法，计算胰岛素敏感指数(HomaIR)：HomaIR=FG×FINS/22.51.4卵巢标本采集及处理腹腔注射水合氯醛（0.3mL/100mg）麻醉

6、，打开腹腔，用去RNA酶处理过的机械取出双侧卵巢，去除表面脂肪组织并称质量，一侧用10%中性福尔马林固定后石蜡包埋，留作光镜下（HE染色）观察卵巢形态学改变和免疫组织化学实验；另一侧存于-80℃冰箱，留作PCR检测。1.5卵巢中ObR表达常规石蜡包埋，连续冠状切片，厚4μm，共3套，分别用于HE染色、免疫组织化学染色及其对照试验。按Elivision免疫组织化学方法进行操作，一抗为羊抗兔LEP受体抗体1∶100（北京中杉金桥生物技术有限公司），25℃过午；二抗50μL为羊抗兔（福州迈新生物技术开发有限公司）30min，DAB显色3～5min，苏木素复染1min。结

7、果判定参照文献[6]，阳性为细胞内出现黄色颗粒。按染色强度与阳性细胞百分数判定，>50%细胞着棕黄色为强阳性，评3分；<50%细胞着棕黄色或>50%着黄色为阳性，评2分；<50%细胞着黄色或均着淡黄色为弱阳性，评1分；不着色为阴性，评0分。每个标本观察8个视野，双盲法评估结果。1.6卵巢中ObRmRNA的表达1.6.1总RNA提取每100mg组织加1.0mL的Trizol溶液，充分研磨组织后，室温静置5min。加0.2mL氯仿用力振荡15s，室温静置5min。4℃，12000r/min离心15min。吸上清，加入