基因工程技术制备的人源性抗mr 48×103 角蛋白抗体fab片段的纯化与活性鉴定

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1、基因工程技术制备的人源性抗Mr48×103角蛋白抗体Fab片段的纯化与活性鉴定　　摘要:目的用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体Fab片段，并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定.方法将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，产物经金属鏊合层析纯化，并用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性、SDS-PAGE鉴定纯度和蛋白印迹检测抗角蛋白抗体Fab片段识别的抗原组分.结果可溶性表达的抗角蛋白抗体Fab片段经金属鏊合层析可有效地纯化，蛋白印迹明确纯化产物为人Fab片段.所纯化的Fab片段在非还原SDS-PAGE中形

2、成Mr50×103单一条带，在还原SDS-PAGE中可见Mr23×103，Mr25×103两条带.ELISA和r48×103角蛋白的Fab可溶性片段，为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了良好的基础.　　Keyanantibody;Fab;preparation;i-dentification　　Abstract:AIMToexpresshumanFabfragmentagainstMr48×103keratininE.coli，andidentifyitspurity，biningactivitiestheestablishedse

3、misyntheticphageantibodylibraryandtrans-formedintoE.colixL1-blue.ThespecificFabfragmentsmobilizedmetalionaffinitychromatography（IMAC），theexpressedproductsentcouldbeefficientlypurifiedbyIMAC，andthepurifiedproductsanFabfrag-mentbyr48×103角蛋白的Fab阳性克隆RRKZ由海军总医院中心实验科王刚提供.该抗Mr48×103角蛋白的Fab阳性质粒含有抗角

4、蛋白抗体的全部轻链基因（CL+JL+VL）及木瓜酶酶切位点以上部分的重链基因（CH1+JHD+VH），两部分基因克隆于可溶性Fab表达载体p3MH.该载体系在pB3H的基础上于基因Ⅲ3’端加了6个组氨酸编码序列，以利于表达产物的纯化.表达产物为人源性抗角蛋白的Fab片段.诱导剂:异丙基-β-D半乳糖苷（IPTG）（Promega）.人表皮角蛋白抗原和IgG型AKautoAb由本室制备.HRP-羊抗人IgGFab抗体及镍离子螯合层析柱分别为Sigma公司和Pierce公司产品.　　1.2方法　　1.2.1人源性抗角蛋白Fab片段的原核表达将阳性克隆RRKZ的质粒转化大肠杆菌XL

5、1-blue，挑取单集落在1.5mL2YT培养液中振荡培养至A600nm≈0.6，然后按1∶100扩大培养，3h后加IPTG至终浓度为1mmol・L-1，37℃诱导过夜.次日收集菌液离心，上清中即含有可溶性Fab抗体.　　1.2.2人源性抗角蛋白Fab片段的纯化人源性抗角蛋白Fab片段的纯化步骤基本按试剂盒说明进行.方法是:人源性抗角蛋白Fab片段原核表达上清先用50%饱和度硫酸铵盐析沉淀，pH6.8平衡缓冲液透析后上柱，分别用洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2洗脱非特异结合的蛋白，再用洗脱缓冲液解离特异的Fab片段，收集解离液，透析后经BCA蛋白检测试剂盒定量备用.　

6、　1.2.3人源性抗角蛋白Fab片段的纯度与结合活性纯化产物经100g・L-1SDS-PAGE鉴定纯度，并用纯化抗体与角蛋白以及无关抗原HBsAg、结蛋白、铁蛋白、胃蛋白酶等的ELISA反应判断其结合活性和特异性.各种抗原均以碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释至1.25mg・L-1包被酶联板4℃过夜，经10g・L-1BSA封闭后滴加1∶10和1∶100稀释的纯化抗体洗脱液37℃孵育1h，PBS（T值.　　1.2.4蛋白印迹检测用于检测Fab的表达情况以及鉴定人源性抗角蛋白Fab结合角蛋白的组分.①将纯化样品在100g・L-1

7、胶浓度下进行SDS-PAGE电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上，以50g・L-1脱脂奶粉-PBS4℃封闭过夜，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgGFab抗体结合，孵育、洗涤，DAB显色;②将角蛋白抗原在100g・L-1胶浓度下进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后取下凝胶，转移至硝酸纤维素膜，以50g・L-1脱脂奶粉-PBS4℃封闭过夜，滴加纯化的人源性抗角蛋白Fab，室温摇床孵育2h，洗涤，加用辣根过氧化物酶标记的抗人IgGFab抗体再次孵育，洗涤，DAB显色.　　2结