刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响

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1、刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响：刘天丹黄良国王凤英蒋国红【摘要】　　目的观察刺五加（AS）对脑出血（ICH）大鼠脑细胞凋亡及其对凋亡调控蛋白Bcl2、Bax的影响及对ICH脑组织的保护作用。方法雄性ethodsMaleal,model,shamoperatedandtherapygroups.ThetherapygroupincludedhighandloesandapoptosislevelandthechangeofBcl2,Baxodelgroupat12h,1,3and7d(P＜0.01,P＜0.05).Theexpre

2、ssionofBcl2proteinintherapygroupodelgroupat12h,1,3and7d(P＜0.01,P＜0.05).TheexpressionofBaxproteinintherapygroupodelgroupat12h,1,3and7d(P＜0.01,P＜0.05).ConclusionsAScouldgreatlyreducetheamountofapoptosiscellsafterICH，orrhage;Acanthopanaxsenticosus;Apoptosis;TUNEL;Bcl2;Bax

3、　　脑出血（ICH）后血肿周围组织继发性损伤机制研究为临床药物干预治疗ICH提供了科学依据。刺五加（AS）对缺血性脑损伤的治疗作用已被临床与动物实验所证实，对于出血性脑血管病，临床上也已广泛应用。AS治疗ICH机制，目前尚不完全清楚。本实验旨在观察ICH后血肿周围组织神经细胞凋亡和Bcl2、Bax蛋白表达基础上，采用AS干预治疗，探讨AS对其影响及脑保护作用。　　1材料与方法　　1.1实验材料　　健康a公司；兔抗大鼠Bcl2、Bax单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购于北京博奥森生物工程有限公司；AS注射

4、液（20ml/支,批号200703162）由黑龙江完达山制药厂生产。　　1.2实验方法　　1.2.1动物模型制作　　参照Rosenberg的大鼠ICH模型制作方法〔1〕，实验大鼠禁饮食12h之后，以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上。局部消毒后“丁”字形剪开颅顶皮肤，按照《大鼠脑立体定位图谱》〔2〕定位尾状核，前囟为0点，向右旁开3mm,向前0.2mm，牙科钻钻透颅骨，钻孔直径0.8mm，微量注射器针头垂直刺入脑组织，进针5.5mm（右侧尾状核所在部位）。向大鼠的右侧尾状核缓慢注入0.5μl（1

5、U）胶原酶，留针10min后缓慢拔出穿刺针，缝合皮肤，予局部消毒。假手术组以等量生理盐水代替胶原酶注入右侧尾状核。动物苏醒后，放回笼内饲养，正常进食进水，室温37℃左右。　　1.2.2大鼠选入标准　　根据Bederson神经缺损体征评分法〔3〕进行综合等级评分。缺损体征达3级及以上者为制模成功。断头取脑后沿进针道切开可见明显血肿。不符合条件的大鼠弃去，重新补充。　　1.2.3大鼠分组与给药随机将大鼠分为5组。　　①正常组：大鼠6只,普通饲养，不作任何处理，饲养1l生理盐水腹腔注射，以后每日1次，直到处死为止。　　③模型组：大鼠30只，制

6、作ICH模型（见上述）术后处理同假手术组。　　④AS小剂量组：制模成功后，每日给予AS注射液，6.25ml/kg体重，加生理盐水至2ml，每日1次腹腔注射。　　⑤AS大剂量组：制模成功后，每日给予AS注射液31.25ml/kg体重，分2次腹腔注射，二次注射间隔8h以上，直到处死为止。除正常组外分别在术后6、12h、1、3、7d断头取脑制作标本，每个时间点观察6只大鼠。　　1.2.4组织取材　　在相应的时间点用水合氯醛麻醉大鼠，开胸，左心室插管灌注，右心耳剪开引流。先灌注生理盐水150ml,再以4%多聚甲醛灌注至大鼠发白僵硬，然后快速断头

7、取脑。沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处，可见血肿灶。以穿刺点为中心，冠状面取厚度5mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4h，脱水后石蜡包埋。以血肿灶为中心制作水平位脑组织切片，切片厚度4μm做苏木素伊红（HE）染色和免疫组织化学染色。　　1.3检测方法　　1.3.1HE染色方法观察组织病理学变化　　切片经梯度酒精水化、HE染色、封片等程序处理后，在光学显微镜下观察血肿周围组织病理变化。　　1.3.2血肿周围组织细胞凋亡水平TUNEL染色法检测细胞凋亡。切片经过氧化氢、复合消化液处理，加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，37℃孵育1h

8、,用链霉亲和素孵育，DAB显色，HE复染。对照组以磷酸盐缓冲液（PBS）代替人末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）。阳性细胞核呈棕黄色颗粒状。高倍光镜下(400倍)计算凋亡指数(AI),即每张片选取不重叠10个细