无菌工艺快速微生物检测方法

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1、无菌工艺快速微生物检测方法       自21世纪初以来，国际制药工业界在无菌药品生产领域开展了一项重要的检测技术——快速微生物检测（RMM，RapidMicrobiologicalMethods），包含快速检出和鉴定。       在多年制药工业实践中，许多实验室发现当微生物养分被剥夺，或抗菌剂，如防腐剂、消毒剂、高温蒸汽或去污染气体的浓度达亚致死量时，微生物会发生应激，无法在传统人工介质上复制培养。因为这种培养不能达到最佳复活条件，微生物不能增殖。当这种情况发生时，无菌培养阴性不能证明产品没有受到

2、污染。另外，无菌培养需时较长，不能实时发现产品生产过程中发生的污染，不能使产品快速放行，增加仓储时间和成本。于是，人们希望开发出新的微生物检查、定量和鉴定方法。       近年来生物检测技术高速发展并迅速向制药领域渗透。当前RMM各类技术平台已经能够检测到多种微生物及变异微生物；能明确样品中微生物的数目；识别微生物的属，种和亚种。这些技术主要分为基于微生物培养的快速发现和鉴定技术、活细胞识别鉴定技术和基因及芯片识别鉴定技术。基于微生物培养的快速发现和鉴定技术       基于微生物培养的快速发现和鉴

3、定技术是在微生物培养过程中早期快速发现微生物生长。       电阻监测系统能测量微生物生长过程中液体介质中电势的变化。微生物生长过程中，较大的，不带电的分子分解为较小的，高度带电的分子，如蛋白质变成氨基酸，脂肪变成脂肪酸，多糖变成乳酸等。通过监测电极间离子移动（电导率）或电极表面电荷数量（电容），检查是否有微生物生长。bioMérieuxBactometer系统就是基于这一原理。微生物液体培养时会产生CO2，在密闭容器中，可通过监测容器中CO2含量的变化来检测微生物生长。BacT/ALERT系统设备

4、是bioMérieux的第二代技术。该技术将微生物生长产生的二氧化碳扩散至液体乳胶传感器，触发颜色警报器，告知用户检测到微生物。GenzymeBiosurgery已将这种技术用于其细胞培养产品的快速无菌检查。       所有活的细胞都以ATP（AdenosineTriphosphate）的形式储存能量。当ATP转化为AMP（AdenosinMonophosphate）时会发生生物发光现象。因此，人们可利用检测细胞ATP来证明微生物存活情况。可利用ATP释放剂提取样品中微生物细胞中的ATP，然后加入反

5、应剂，检测样品中的发光量。根据所测光量判断微生物的存在情况，或指出光量与实际细胞数的相关性。如果样品中微生物水平非常低，则需要先在液体介质或琼脂上进行复制，以增加ATP含量，从而便于检测。Millipore'sMilliflex快速检测系统设备、CelsisAdvanceLuminometer、PallChek微生物学系统设备均是根据这一原理进行检测。       研究发现，所有微生物细胞都存在自发荧光光谱。这与细胞内黄素类如核黄素、黄素蛋白等物质有关。GrowthDirect系统设备用于快速检测琼脂

6、表面是否有微生物生长。可较早检测到小菌落发出的黄绿色荧光。       微生物代谢时可利用某些生化物质和碳水化合物。利用这一机制，BiologOmnilog系统设备在反应井中放有含有脱水碳源的四唑紫染料，如果微生物利用这种碳源，则该井变紫色。利用不同波长可见光监测每个井的变化，检测浊度（微生物生长引起）或代谢产物的颜色。系统产生的数据结果，通常用“+/-”表示，与内部数据库或相关图书馆提供的特异平台和微生物鉴别结果相比较。活细胞检测技术       利用这类技术可区分活细胞和死细胞。可使用针对特异微生

7、物的核酸、酶、单克隆抗体探针，直接给单个细胞标记，不需介质培养。多用于检测和/或定量测定孢子、应激细胞、需复杂营养的微生物、活的、不能培养的微生物。标记可在数小时甚至数分钟完成，几乎可获得实时结果。       常用的有流式细胞仪和固相细胞仪。流式细胞仪是将标记过的细胞液样品放入检测腔，让样品中的细胞形成细胞束逐个快速流经有激光束照射的腔室，发出荧光和光散射信号的为活细胞，可以计数。标记和检测可在15min内完成。所需样品量少，不超过1mL。市售设备有ChemunexD-Count和BactiFlow

8、系统等。       固相细胞检测仪如ChemunexScanRDI系统设备是让样品通过涂有特定物质的过滤器，这种物质可被活细胞代谢时细胞质中的酶分解，分解释放荧光剂，标记活细胞。接着整个细胞表面进行激光扫描，完成标记微生物的定量测定。系统完成标记和检测工艺大约需要90min。系统也可在数小时内，利用抗体和核酸探针进行特异微生物的检测和定量测定。       与传统的介质培养法相比，利用这种技术获得的微生物数量更多，更适宜用于环境应激类微生物即暴露在消毒