DB62∕T 2689-2022 犊牛腹泻病防治技术规范(甘肃省)

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ICS11.220CCSB4162'TAh甘肃省巴方析、准0862/T2689--2022代替DB62/T2686--2016中卖牛腹泻病防治技术规范Technicalspeci且cationsforpreventionandtreatmentofcalfdia盯hea2022-06-30发布2022-07-31实施甘肃省市场监督管理局发布

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20862/T2689--2022目IJ1=1本文件按照GB/T1.1--2020((标准化工作导则第l部分标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替DB62/T2689--2016((辍牛腹泻病防治技术规范))，与DB62/T2689--2016((核牛腹泻病防治技术规范》相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下a)更改了规范性引用文件;b)更改了术语和定义;c)完善了对牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌、隐J包子虫引起的棋牛腹泻病等疫病的定义、流行病学、|陆床症状、病理变化和防治技术等内容;d)完善了"预防"章，包括饲养管理、消毒、免疫接种、无害化处理4条内容;e)完善了"治疗"一章，f)增加了牛冠状病毒酶联免疫吸附试验(ELISA)操作方法、大肠杆菌培养、粮牛隐J包子虫gp囊分离鉴定方法3个规范性附录。本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。本文件由甘肃省畜牧业标准化技术委员会归口。本文件起草单位:甘肃省动物疫病预防控制中心、~县麻子川镇畜牧兽医站、庄i良县良邑镇畜牧兽医站、甘南州动物疫病预防控制中心、华池县城嚎镇农业农村综合服务中心、合作市动物疫病预防控制中心、|自潭县冶力关镇畜牧兽医站、Ilffij草县羊沙镇畜牧兽医站、永登县树屏镇农业农村综合服务中心、华池县山庄乡农业农村综合服务中心。本文件主要起草人:张小宁、文Ij剑鹏、文立波、肖敏、刘世杰、李改红、李小玲、李勇生、索明艳、贾丽娜、洪海凤、杨玉斌、李万志、赵朝霞、杨欢。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:2016年首次发布为DB62/T2689--2016;本次为第一次修订。本文件白甘肃省动物疫病预防控制中心负责解释。各单位或个人在执行本文件过程中如发现需要修改和补充之处，请随时将意见和建议反馈至《侬牛腹泻病防治技术规范》地方标准编制组(地址甘肃省兰州市城关区红柳滩路41号，邮编730046，联系人:张小宁，E-mai1:497756430⑧qq.com，联系方式0931-4592020)，以供今后修订时参考。I

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40862/T2689--2022棋牛腹泻病防治技术规范1范围本文件规定了极牛腹泻病的病原、诊断和防治方法。本文件适用于牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌、隐于包子虫引起辍牛腹泻的防治。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少、的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。.GB13078饲料卫生标准GB/T35942帽子包子虫套式PCfR检测方法GB/T36195畜禽粪便无害化处理技术规范GB/T39915动物饲养场防疫准则NY/T388畜禽场环境质量标准NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1167畜禽场环境质量及卫生控制规范NY/T1949隐于包子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法NY/T3075畜禽养殖场消毒技术NY5027无公害食品畜禽饮用水水质NY/T5030无公害农产品兽药使用准则NY5032无公害食品畜禽饲料和饲料添加剂使用准则NY/T5128无公害食品肉牛饲养管理准则3术语和定义下列术语和定义适用于术文件。3.1棋牛腹泻ca1fdiarrhea主要由牛轮状病毒、冠状病毒、大肠杆菌、隐于自子虫等多种病原引起极牛以随泻为特征的传染病和寄生虫病。3.2牛轮状病毒病bovinerotavirus由轮状病毒引起棋牛精神沉郁、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征的急性胃肠道传染病。3.3牛冠状病毒病bovinecoronavirusdisease由牛冠状病毒引起的核牛以出血性服泻为主要症状的传染病。1

50862/T2689--20223.4棋牛大肠杆菌病bovinecolibacillosis又名大肠杆菌性服泻、极牛白俐，由致病性大肠杆菌引起楼牛肠炎、肠毒血症、腹泻、脱水为主要症状的传染病。3.5牛隐于包子虫病bovinecryp归sporidiosis由隐于包子虫寄生子恢牛肠道进而引起以腹泻为主要症状的种原虫病。4流行病学4.1传染源患病动物、隐性感染者或携带隐于包子虫的动物为主要传染源。4.2易感动物3周龄以内的粮牛最易感。4.3传播途径病原随粪便、尿液、口腔、鼻腔等分泌物排出体外，主要通过污染的饲料、饮水等经消化道传播。4.4流行特点年四季均可发生，冬春季节多发。5[临床症状5.1牛轮状病毒病潜伏期18h~96h，多发生于7日龄以内的依牛。病初精神沉郁，食欲减退，排出黄白色或乳白色教稠粪便;之后腹泻明显，排出大量黄白色或灰白色水样稀便;严重时脱水明显，最后因心力衰竭、代1射性酸中毒，体温下降，最终死亡。5.2牛冠状病毒病急性型，多发子7日龄~1O日龄的核牛，潜伏期为1d~2d，精神沉郁，食欲减退，持续腹泻;感染48h后出现黄色或黄绿色稀便，并持续3d~6d，后期粪便中带有肠数膜和血液，严重者排水样便，重症者在7d内因急性脱水和代谢性酸中毒衰竭死亡，慢性型，2周龄~6周龄楼牛多见，常表现为持续性或间歇性腹泻，有腹痛表现。5.3大肠杆菌病败血型多发于6日龄以内的核牛，呈急性败血病症状;病初体温升高，精神沉郁，食欲减退，腹泻，常子症状出现后数小时至1d内病楼急性败血症死亡。肠毒血症型多发子7日龄以内极牛，急性无明显症状突然死亡。肠炎型多发于7日龄~1O日龄的核牛，病初体温升高，粪便初如粥样、黄色，后呈水样、灰白色，混有未消化的凝乳块、凝血及泡沫。5.4隐于包子虫病2

60862/T2689--2022多发子7日龄~14日龄的核牛，潜伏期3d~7d，精神沉郁，食欲减退，粪便呈黄乳油状、灰白色或黄褐色，有大量纤维素，后呈透明水样稀粪。6病理变化6.1轮状病毒病小肠肠壁菲薄，半透明，内含大量的气体，内容物呈液状、灰黄或灰黑色，肠系膜淋巴结肿大。6.2冠状病毒病小肠肠壁菲薄、松弛，俨、结肠棚上皮细胞坏死、脱落6.3大肠杆菌病真胃有大量凝乳块，数wíι出血水肿肠内容物混有血液和气泡J肠服充血，肠壁菲薄，皱榴部有散在针尖状出血点;肠系膜淋巴结肿大、充血;胆囊肿大，充;由占稠、暗绿色胆;lt;心内膜有出血点。6.4隐抱子虫病结肠内有带血和教液的淡黄色水样粪便，大小肠鼓气，知膜充血，绒毛萎缩、变短、融合，有明显的小肠炎和结肠炎病变。7诊断7.1初诊7.1.1符合川、6.1可初步诊断为依牛轮状病毒性腹泻。7.1.2符合5.2、6.2可初步诊断为核牛冠状病毒性腹泻。7.1.3符合5.3、6.3可初步诊断为核牛大肠杆菌性腹泻。7.1.4符合54、64可初步诊断为辍牛隐于包子虫感染引起的腹泻。7.2确诊7.2.1符合711，且符合实验室诊断结果(按照附录A执行)，可确诊为核牛轮状病毒性腹泻。7.2.2符合712，且符合实验室诊断结果(按照附录--B执斤)，可确诊为恢牛冠状病毒性腹泻。7.2.3符合713，且符合实验室诊断结果(按照附录C执行)，可确诊为核牛大肠杆菌性腹泻。7.2.4符合714，且符合实验室诊断结果(按照盼录D执行)，可确诊为核牛隐于包子虫感染引起的腹泻。8预防8.1饲养管理8.1.1饲养管理按照GB/T39915,NY/T5128和NY5032的规定执行。8.1.2饲料卫生标准符合GB13078，饮水要求按照NY5027的规定执行。8.1.3环境控制应符合NY/T388、NY/T1167的规定。3

70862/T2689--20228.2消毒8.2.1消毒技术按照NY/T3075规定进行，消毒药的选择和消毒程序按NY/T5030的规定执行。8.2.2严格控制人员、车辆、相关物品出入，严格执行清洁和消毒措施。8.2.3做好牛舍、场地、用具的消毒。8.2.4对哺乳母牛乳头彻底清洗干净、消毒。哺乳壶、桶、奶嘴、毛巾等哺乳用具用后要严格煮沸消毒，晾干，用前用85"C以上热水或蒸汽消毒。8.2.5养殖场粪污处理严格按照GB/T36195的规定执行。8.3免疫接种按照制定的免疫程序，对所饲养的牛用国家批准生产的疫苗进行免疫接种。8.4无害化处置病死或死因不明槟牛按照规定进行无害化处理。9治疗9.1兽药使用应符合NY/T5030的规定。9.2针对轮状病毒和冠状病毒引起的腹泻，及时隔离，防止继发感染;针对酸中毒，静脉注射5%碳酸氢纳注射液，每次100mL~200mL.或1.9%乳酸纳格液500mL~1川mL。9.3对持续腹泻不止的粮牛，可应用明矶、次硝酸锐、硅酸银、颠茄líJ(或流浸膏)，内服。9.4因隐于包子虫引起的腹泻，磺胶类药物或氨丙陪院有定效果。氮氧灭球灵、氨丙琳和氯甲贯主毗院是治疗球虫病较有效的药物。9.5及时补充体液，若脱水仅占体重8%以下时，给予口服补液;若脱水占体重8%以上或腹泻严重时，应在给予口服补液的同时，皮下或静脉注射含有碳酸纳的林格氏液。9.6制止肠内腐败、发酵过程，除应用抗生素和磺胶类药外，也可适当选用乳酸、克辽林等防腐制酵药物。因大肠杆菌性腹泻引起的极牛腹泻，可用敏感抗菌药物治疗。4

80862/T2689--2022附录A(规范性)牛轮状病毒病原学检现IJ方法A.1样品采集样品采集按照NY/T541的规定执行。采集的样品在2"C~8"C条件下保存应不超过24h;如需长期保存，应放置-20"C下保存，避免反复冻融。A.2样品处理A.2.1粪便样品腹泻辍牛的粪便以5倍体积生理盐水稀释后，3000r/min、4"C离心30min，取上清液，以0.22μm微孔针头滤器过滤除菌待检。A.2.2组织及内容物样品取小肠和肠内容物。2g，用含有lωIU青霉素和100阳链酵的DMEM培荠液浸泡冲洗两次，然后剪碎装进研磨器句，在研磨器内加入2mL无血清DMEM细胞培养液，研磨成糊状，制成10%组织悬液，lω00r/min、4"C离心15min，吸取上清液，用。22μm微孔针头滤器过滤除菌待检。A.3牛轮状病毒微滴式数字RT-PCR检测l方法提取待检样品的病毒RNA，进行微滴化处理，微j商生成后，在PCR扩增仪上进行微滴式数字RT-PCR扩增。A.4结果判定样品中牛轮状j病毒基因未得到J扩增，扩增终点荧光信号低于阂值，判定为阴性。样品中牛轮状病毒基因得到扩增，扩增终点荧光信号高于阂值，判定卢阳性。5

90862/T2689--2022附录B(规范性)牛冠状病毒酶联免疫吸附试验(ELISA)操作方法8.1检测样本血清、血浆、细胞上清液、组织匀浆、尿液、胸腹水、脑脊液，样本如不能及时检测应-20-C冷冻保存，避免反复冻融。8.2实验原理及类型将己知抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体或酶标抗原不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或或定量测定。ELISA可用于检测抗体，也可用于检测抗原。8.3样本处理及要求8.3.1血清全lÍU标本子室温放置2h或4-C过夜后于1000g离心20min，取上清液即可检测，或将标本放子-20-C或-80-C保存，但应避免反复冻融。8.3.2血浆可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集30min内子2-C~8-CI000g离心20min，或将标本置于-20-C或80-C保存，但应避免反复冻融。8.3.3细胞培养物上清或其它生物标本1000g离心20min，取上清液即可检测，或将标本置于20-C或80-C保存，但应避免反复冻融。8.4操作步骤8.4.1从室温平衡20mm后的铝街袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4-C。8.4.2设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。8.4.3样本孔中加入待测样本50件L;空白孔不加。8.4.4除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入过氧化物酶CHRP)标记的检测抗体100此，用封板膜封住反应孔，3TC恒温箱温育60min。8.4.5弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置lmin，用去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。8.4.6每孔加入底物A、B各50μL，3TC避光孵育15mm。8.4.7每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。6

100862/T2689--2022附录C(规范性)大肠杆菌鉴定C.1菌种;东存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉浪中加九等量40%甘油，-80"C;幸存。C.2培养基制备LB培养基配方(Æ亮化蛋白陈IOg止;酵母提取物5g!L;NaOI'J-8.g止pH74)液体培养基膜化蛋白陈IÓ.Og酵母粉5.0g氯化纳IOPg水1000mLpH74固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5%~2.0%的琼脂C.3平板的制备C.3.1称取1亮化蛋白俨川g，酵母粉5饨，NaCI10协加入刷mL水珞解，并用眼璃棒搅拌均匀，用Imol!L的NaOH调pH至74左右，定容至IL.调pH74(若i自液pH大子74，用Imol/lJHCI回调)。C.3.2分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂(]50mL液体培养基加入2.5g琼脂)。C.3.3在锥形瓶口依次盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。C.3.4高压蒸汽灭菌锅121"C灭菌15mm。C.3.5灭菌后的培养主取出置电热鼓风干燥器内60"C烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30mm以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个、培养皿培养基约IOmL~15mL(直倒在时，在培养皿中厚度大约4mm左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置IOmin左范，待琼月旨基本凝固可涂平板。C.3.6若平板不直接使用，周后将培养基在机E保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。C.4接种大肠杆菌C.4.1取储备的大肠杆菌BL2])幸存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。C.4.2接种方法一:用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间tlJ之字，接种方法二用移液检吸取100μLì自液子平板上，用酒精灯灭菌后的涂抹棒划十字，涂布平板。7

110862/T2689--2022C.4.3涂平板时应考虑J幸存液内细菌数量，若菌量过大应适当稀释。一般方法获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒精灯附近进行，若冻存液涂完的平板应倒置，防止平皿盖上产生水蒸气。C.5大肠杆菌的培养C.5.1将接种好的平皿倒置放入3TC恒温培养箱中培养，大约十几小时后长出菌落。C.5.2挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的LB液体培养基中3TC，220rpm/min恒温振荡培养9h~12h。菌落特征:乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。8

120862/T2689--2022附录D(规范性)棋牛隐于包子虫卵囊分离鉴定O.1隐于包子虫卵囊的提取用次性手套采集2周龄~4周龄的核牛新鲜粪便，置于同体积5%的K2Cr207中，4"C保存待检。用不连续庶糖密度梯度离心法提取隐于包子虫gp囊，提取的gp囊置于2.5%K2Cr207自液中，4"C保存备用。0.2涂片镜检z、〉用胶头;商管吸取经上述方法初步纯化的gp囊液，3000r/min~离心15min，沉淀用PBS洗2次除去K2Cr207,gp囊悬子PBS。吸取适量稀释好的gp囊液，1商于载玻片上并加盖盖玻片，立即在400倍显微镜下测量其大小和lω0倍油镜下观察卵囊形态。0.3单克隆抗体检测隐于包子虫卵囊r采用间接免疫荧光试验检测隐于包子虫gp囊，吸取经上述方法制备的gp囊液，1高于干净的载玻片上，自然凉干，用蜡笔在气品周围画圈，火焰固定;滴加抗小隐抱子虫卵囊单克隆抗体约25μL子载玻片的样品上，3TC孵育30min;0.01M'pH7.4、PBS缓冲液洗3次;滴加按要求稀释的异硫氢酸荧光素标记的羊抗鼠抗体子样品上，3TC孵育30mm;0.01MpH7.4PBS缓冲液再洗3次;磷酸甘油缓冲液封片，400倍荧光显微镜下视察。10.4小鼠感染试验实验小鼠5只，体重12g~14g,4周龄，雌性。实验前彻底消毒器具和环境。实验期间，每日每鼠用地塞米松磷酸纳125吨饮水。在连续5d收集所有小鼠粪便检测隐于包子虫gp囊，证明均为阴性后，给所有小鼠灌服经上述1方法制备并用PBS洗2次除去K2Cr207的gp囊液100μL(252x196个ImL)。灌服gp囊液后的第3天起，开始收集粪便，用不连结庶糖密度梯度离心法提取隐抱子虫~p囊，400倍显微镜下观察。0.5镜检鉴定0.5.1光镜观察在400倍光学显微镜下观察到的~p囊形态近似球形，轻脚动微i伊钮时，可以看到这光小体情呈粉红色。在1000倍油镜下观察，gp囊壁光滑-'-无色，如囊向可见毅量不等的暗色颗粒或点状遮光物。0.5.2荧光显微镜观察用单克隆抗体或间接免疫荧光试验处理的样品置4ω倍荧光显微镜下可观察到大量的隐J包子虫gp囊，形态为球形，表面被绿色荧光环所覆盖。0.6隐于包子虫卵囊检测技术改良抗酸染色法0.6.1检测l方法按照NY/T1949的规定执行。0.6.2结果判定9

130862/T2689--2022用高倍显微镜(400x)观察涂片，隐J包子虫gp囊在黄绿至蓝绿色背景下为粉红色至紫红色的球形或卵圆形虫体。发现疑似卵囊后，应该在油镜(]OOOx)下确诊。油镜下，gp囊里鲜半色玫瑰红色，外周有层发亮的gp囊壁;内有4个月牙形或逗点状结构即子袍子，还有圆暗黑色颗粒状的残体，有的着色深，内部结构明显;有的着色淡，内部结构不够明显。每张涂片连续观察20个视野，发现~p囊即为阳性。每个样品观察2张涂片。感染以每张涂片20个视野中(400x)的gp囊数表示。未发现gp囊者为阴性""。在涂片上常见到与隐于包子虫gp囊大小相似的酵母，应注意区别。酵母通常呈长椭圆形，没有层发亮的外壁，无结构，在较大的母细胞上生长着较小的子细胞，两者间里藕节状连接。O.7隐于包子虫套式PCR检现IJ方法0.7.1检测方法按照GB/T35942的规定执行。O.7.2结果判定被检样品泳道出现一条大小约为830bp条带时，判为阳性，必要时进行测序。被检样品没有出现大小约为830bp的条带，经重复2次套式PCR检测后仍未出现扩增条带时，判为阴性。O.8饱和l!f.糖溶液漂浮法检现IJ在含有样品的离心管中加PBS，吸管反复吹打冲洗自液转移到100mL烧杯中，加PBS至20mL,用压舌板搅匀。用囚层无菌纱布过滤i自液子50mL离心管中，3000rpm/min，离心10min，弃上清。沉淀加15mL饱和庶糖i窑液，用玻璃棒搅匀，15ω叩m/min，离心IOmin。用直径。5cm~1cm的铁丝圈勾取液面表层-~商加到载玻片上，盖上盖玻片，400倍显微镜下镜检。镜检可见直径在3μm~8μm之间，呈玫瑰红色的圆形或椭圆形的小点，为隐于包子虫~p囊。10