聚合酶链式反应(PCR)

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1、实验二、聚合酶链式反应（PCR）实验内容：采用PCR法进行基因扩增目的要求：掌握PCR反应的原理和方法实验原理：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸

2、引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。试剂准备：1.DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCRBuffer4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶操作步骤：1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。       10×PC

3、Rbuffer               2.5μlMg2+2μl      dNTPmix（2mM）             0.5μl  　 引物1（10µM）                1μl   　引物2（10µM）                1μl      Taq酶（2U/μl）             0.25μl      DNA模板（50ng-1μg/μl）　  1μl      ddH2O                    16.75μl总体积25μl   视PC

4、R仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般程序：93℃预变性3min，93℃变性30s58℃退火(温度视引物Tm值而定)30s30-35循环72℃延伸90s，72℃保温10min。3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4．PCR的电泳检测：配制1%的琼脂糖凝胶，胶体凝固后取5-10μlPCR产物进行电泳检测。思考题：(1)PCR反应产物经电泳检测，出现非特异性条带的可能原因？(2)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

5、的原理？