全国流感监测技术指南

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1、附件2：流感监测实验技术操作规范一、流感监测临床标本的采集、运送、处理及流感病毒株的运输（一）流感临床标本的采集病毒分离成功与否很大程度上取决于临床标本的采集时间、质量及其保存和运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织。标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存。常用的采样液有以下三种：pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's或者DMEM培养基。为防止采样液生长细菌和真菌，在采样液中可加入抗菌素，加入庆大霉素（终浓度为1mg/mL，Gibco,cat.no.15750-078）和/或制霉菌素

2、（终浓度为50U/mL）。加入抗菌素以后重新调节pH值至7.4，分装每个采样管3mL，-20℃冻存。常用采样方法有以下几种：1.鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子平行于上颚插入鼻孔，旋转，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。2.咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁，应避免触及舌部。同样将拭子头浸入采样液中，弃去尾部。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。3.38鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收

3、集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用3～5mL采样液涮洗收集器3次。此外，对于尸检组织，必要时采集尸检的肺组织标本进行病毒分离。（二）临床标本运输新鲜采集的临床标本应在4℃条件下48h内运送至流感监测网络实验室。未能48h内送至实验室的，应置-70℃或以下保存。标本送至实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h内能进行检测的可置于4℃保存，否则应置-70℃或以下保存。冻存的临床采集标本应在冻存的条件下，低温送至实验室。冻存的标本送到实验室后，应尽快进行相应实验室检测，48h内能进行检测的可置于4℃保

4、存，否则应置-70℃或以下保存。标本应避免反复冻融。临床标本采集管建议使用带螺口的塑料管。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。（三）临床标本处理临床采集标本送至实验室后，须经处理后再进行病毒的分离接种。若为带有聚丙烯纤维的拭子标本，应先将带有聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出。鼻咽抽取液：用干净灭菌的毛细吸管在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。上清液可直接接种或低温保存。38组织标本的处理：取肺组织标本放至平皿中，用灭菌生理盐水清洗肺组织2～3遍

5、，研磨成组织悬液，配置成10％～20％的组织悬液，2000rpm离心10min，加入抗菌素，取上清直接接种。注：如原始采样液中未加入抗菌素，应在标本接种前补加，庆大霉素终浓度为10mg/mL，青/链霉素（终浓度:青霉素G100U/mL,硫酸链霉素100μg/mL），混匀后置4℃过夜或作用2h后进行接种。临床标本处理后，将原始标本分为三份，一份用于鸡胚接种，一份用于MDCK细胞接种，一份保存待复核用。对于病毒分离阳性的原始标本-70℃至少保存6个月，在收到国家流感中心复核鉴定报告后，按照生物安全有关规定处理；病毒分离阴性的标本随时按生物安

6、全的有关规定处理。（四）血清标本的采集、处理、运输和保存血清标本多用于流感暴发时的血清学核实诊断。血清标本采集应该包括急性期和恢复期双份血清,单份血清不能用作诊断。急性期血样应尽早采集，可在采集病毒分离标本的同时采集，但不能晚于发病后7天。恢复期血样则在发病后2～4周采集。一般采集空腹血。1.取一根体积5mL以上，无菌的血清管做好标记，并进行登记。登记的内容包括：医院名称、患者姓名、性别、急性期（Acute，A）或是恢复期（Convalescence，C）、采样日期（年，月，日）。2.从患者手臂静脉采5mL血，放入准备好的上述血清管中。

7、3.放置于室温数小时待血液完全凝固。4.1500～2000rpm离心10min，收集血清于无菌管中，做好标记。5.无菌条件下采集的血清可置4℃存放138周，非无菌条件下采集的或存放超过1周的血清需置-20℃或以下保存。应尽量避免反复冻融。（五）流感病毒株的运输需送国家流感中心实验室检测的流感毒株，在流感监测信息系统填写“流感毒株送检单”，提交并打印送检单，加盖单位公章。在冻存后，低温条件下，送至国家流感中心进行复核检测，运输时应遵守国家生物安全的有关规定。1.流感毒株的送检要求（1）流感样病例标本各网络实验室对所有血凝滴度≥1：16的流

8、感毒株，同时分别上送国家流感中心和省级疾病预防控制中心，送检量每份不少于3mL。各网络实验室分离的毒株从标本采集到送至国家流感中心的时间不超过1个月。每个开展病毒分离的网络实验室每年向国家流感中心上送不低于