最新食品酶学课件本(第三章酶的分离纯化第四节分离方法2)教学讲义ppt课件.ppt

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1、食品酶学课件本(第三章酶的分离纯化第四节分离方法2)分离方法分述一、离心分离法二、过滤与膜分离三、沉淀分离法四、层析分离法五、电泳分离法六、酶的结晶七、浓缩与干燥8/30/20212四、层析分离法原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排

2、阻层析。是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。8/30/20213离子交换原理图8/30/202173、离子交换剂的种类基质电荷基团疏水性：人工合成的与水结合力较小的树脂类物质，分离小分子物质。大孔树脂可用于酶。（离子交换树脂）亲水性：天然或人工合成的与水结合力较大的物质。（离子交换纤维素、离子交换凝胶）阳离子交换剂：电荷基团为（-），反离子为（+），与溶液中的阳离子交换，分为强型和弱型阴离子交换剂：电荷基团为（+），反离子为（-）

3、，与溶液中的阴离子交换，也分为强型和弱型常用的离子交换介（基）质离子交换剂保存剂8/30/20218亲水性离子交换剂离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、AE-纤维素、CMC（羧甲基纤维素）等。离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换和分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰

4、胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SP（磺酸丙基）葡聚糖凝胶等。8/30/20219常用离子交换介质8/30/202110离子交换剂保存剂8/30/2021114、离子交换剂的选择强弱离子交换剂的选择：强型：适用范围广，无离子水中或极端pH条件下稳定。弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。酶蛋白的pI为6-9时，考虑用强型离子交换剂。基质的选择：分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。离子交换剂类型的选择：考虑酶的稳定性酶在pH＜pI的条件下稳定，酶带正电，用阳离子交换剂；酶在pH＞pI的条件下稳定，酶带

5、负电，用阴离子交换剂；在两种条件下都稳定时，二种交换剂都可应用。8/30/2021125、离子交换层析操作流程①离子交换剂可装成离子交换柱进行柱层析；②可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。离子交换柱层析主要操作过程：（1）离子交换剂的处理与装柱（2）上柱（3）洗脱和收集（4）离子交换剂的再生8/30/202113（1）离子交换剂的处理与装柱①预处理：浸泡与脱气将干燥的离子交换剂用水浸泡2h以上，充分吸水膨胀后，减压抽除气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清。再先后用4倍体积左右的2mol/L盐酸和2mol

6、/L氢氧化钠浸泡各4h，再用无离子水洗至中性。②转型经上述处理后的离子交换剂需经转型，使离子交换剂所带的可交换离子转变为适当的离子型。如阳离子交换剂用NaOH处理，转为Na+型；用HCl处理，转为H+型。阴离子交换剂用NaOH处理成OH-型；用HCl处理成Cl-型等。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。③装柱转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离效果有影响，要求装填得均匀，无气泡，无裂纹。装好后，保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。8/30/202114（2）上柱①样品液的控制：上柱时要注意酶液的pH值、温度和离子强

7、度等条件。②上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快均匀地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子交换。继续加入酶液，直至交换剂的交换容量饱和为止。③流速的控制：要控制好流速。流速太快，分离效果不好；流速太慢，则影响分离速度。有时由于离子交换剂颗粒太细，或柱较高，或酶液浓度、粘度较高等原因引起流速太慢时，为加快离子交换层析速度，可采用在柱进口适当加压或在出口适当减压的方法。8/30/202115（3）洗脱和收集①洗未吸附物上柱完毕后，先用水或缓冲液流过层析柱，使未吸附的物质洗出。②

8、洗脱目标物用适当的洗脱液，将吸附在离子交换剂上的离子按亲和力自小至大的顺序逐次洗脱下来，分别收集，以达到分离目的。若酶液组