最新dna链断裂 - 昆明医科大学教学讲义PPT.ppt

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1、dna链断裂-昆明医科大学DNA序列测定（DeterminationofDNAsequence）核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，

2、这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。DNA测序技术（DNAsequencingtechnology）表----特异断裂4种脱氧核苷酸的方法在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制：G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应

3、----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。碱基特异性修饰及裂解（Basespecificmodificationsandcracking）（一）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料。（二）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。（三）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。（四）使标记片段变性为单链。化学法测序（Chemicalmethodofsequencing）的基本步骤（五）分成4-5个反应体系，按上述程序（表或4个机制）

4、化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。（六）电泳（七）放射自显影（八）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。化学法测序（Chemicalmethodofsequencing）的基本步

5、骤化学法测序的基本步骤二、Sanger双脱氧链终止法在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上使链终止的原理。即在A、C、G、T4种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的5′末端，而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。Sanger双脱氧链终止法（Sangerdideoxychainterminationmethod）Sanger双脱氧链终止法三、DNA自动测序（automaticDNAsequencing）采

6、用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA测序自动化和大规模测序的特点原理同末端终止法标记物为荧光染料激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高测序速度快200bp/hDNA自动测序Fourcolorfluorescentdyes(BigDye)Markenditem

7、将荧光素连在4种ddNTPddATP●ddTTP▲ddCTP◆ddGTP★DNA测序基本步骤（BasicstepsinDNAsequencing）测序模板的纯化与定量测序反应--PCR仪测序反应产物纯化与变性上样电泳--测序仪分析结果DNAsequencingpruductpurificationDNAnumberofsequencedtemplatesSequencingreactionsystemandconditionSequencingreactionsequencingpruductpurification

8、single-cellgelelectrophoresis--377single-cellgelelectrophoresis--310single-cellgelelectrophoresis--3100Step１：ThecapillariesglueStep２：specimendiscmoveStep３：elec