高效液相層析儀原理及應用 - NTOU.ppt

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1、HPLC原理及應用益弘儀器股份有限公司層析的由來將一滴包含混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上,隨著溶液的展開可以觀察到一個個同心圓環的出現,這就是最古老的液相色譜分離技術,古代羅馬人就已經採用這樣簡單的方法來分析染料和色素。盡管色譜的使用由來已久,但色譜法的真正建立是二十世紀初期的事情了。移動相固定相史上第一次提出“色譜”名詞的人是俄國植物學家茨維特(Tsweet),他在1906年發表的色譜論文中寫到:將一植物色素的石油醚溶液從一根裝有碳酸鈣的玻璃管上端加入,然後用純石油醚淋洗,結果按照不同色素

2、的吸附順序在管内觀察到它們相應的色帶,他把這些色帶稱之為“色譜團”(Chromatogram)。1960年代，由於氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一台高效液相色譜儀KLA-2(1962)層析分類移動相固定相分析法分析對象氣體固體&液體氣相層析(GC)常溫的氣體樣品或加熱會氣化的樣品液體固體&液體液相層析(LC)液體試料,任何可經溶劑溶解的固體樣品分析對象G

3、C：樣品能氣化、熱穩定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發性差、熱穩定性差、離子型及高聚合物的樣品不可檢測HPLC：溶解後能製成溶液的樣品，不受樣品揮發性和熱穩定性的限制，分子量大、氣化、熱穩定性差及高分子和離子型樣品均可檢測HPLC的組成主要組成有幫浦,進樣器,管柱,偵測器,數據處理器等等移動相進樣器注入樣品管柱偵測器數據處理器幫浦廢液出口方法層析管柱說明逆相HPLC移動相：水/有機溶劑層析管柱：C18（ODS），C8，苯基，三甲基矽烷，氰基首選為能溶於水/有機混合物的中性或非離子化合物。離子

4、對HPLC移動相：水/有機溶劑（一種緩衝物控制pＨ和離子對試劑）層析管柱：C18（ODS），C8，氰基離子或可電離化合物，尤其是鹹性或陽離子化合物正相HPLC移動相：有機溶劑混合液層析管柱：氰基，二醇基，氨基，二氧化矽當逆相或離子對HPLC無效時的第二個較好選擇；首選為不溶於水/有機混合液的親脂(低極性)樣品，異構體混合物和制備HPLC矽膠最好選擇液相色譜的方法主要液相色譜方法特性方法層析管柱說明離子交換層析法移動相：水相，另以緩衝物控制pH層析管柱：陽離子或陰離子交換分離無機離子混合物的首選（

5、離子層析法）；分離蛋白質、核酸樣品及有關化合物的良好選擇體積排除層析法移動相：水相（GFC）或有機相（GPC）層析管柱：GFC用二醇基，GPC用聚苯乙烯或二氧化矽，孔徑大小支配分子量範圍分離大分子樣品，如蛋白質和人造聚合物的良好首選，也可用於測量分子量的分布疏水作用層析法移動相：塩溶液層析管柱：類似於逆相填料，但疏水性小得多用於分離蛋白質選擇液相色譜的方法次要液相色譜方法特性分離模式分子量(GPC,SEC)管柱中的填料，會依樣品的大小不同，將樣品由大而小被分離出來。Copyright©2002b

6、yEHONGCopyright©2002byEHONG串接管柱以提高分析效果離子交換利用離子所帶的電荷強度不同，和固定相之間的離子交換作用，達到分離的效果吸附依固相表面所吸附的基團，對樣品中不同成份的吸附強度不同，而達到分離分配(正相/逆相)流動相選擇不與固定相反應的溶劑，樣品在固定相與移動相間，因分配的溶量因子不同而分離ReversePhaseStationaryPhase:C–18(RP–18,ODS),C–1,C–4,C–8,NH2MobilePhase:Water,Methanol,Ac

7、etonitrile,BufferPH:Pressure:NormalPhaseStationaryPhase:NH2,CN,DIOL,SilicaMobilePhase:n-Hexane,Heptane,Chloroform,Ethanol,2-PropanolPressure:其他如鏡相異構物專用管柱等等逆相管柱填充料類型主要應用範圍特點C18（ODS）可分離多種化合物，最適合用於極性樣品或做離子抑制的樣品的分析適用性好；分離效果强，用途廣。C8與C18相似與C18相似，但分離效果稍小C3，

8、C4多用於肽類與蛋白質分離效果更小C1(TMS)]普通逆相溶劑分析疏水性强的化合物；使用高水含量溶劑分析高極性化合物；分離多基團化合物分離效果最小；最不穩定；可用於逆相與正相苯基，苯乙基多用于分離分析同時含極性和非極性芳香化合物的混合物分離效果適中；選擇性有所不同，對極性芳香化合物選擇性更强；可用於正相。正相管柱填充料類型主要應用範圍特點CN（氰基）適用於在ODS上無分離或分析時間太長，以及極品中同時含有親水與疏水性化合物而在ODS上分析困難時，也可用於氨基酸分析。屬中等級性管柱，適用性好；分離