两种多孔生物玻璃支架材料体外细胞相容性探究

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1、两种多孔生物玻璃支架材料体外细胞相容性探究　　[摘要]目的对比研究采用同样原料但以不同方法制备的两种多孔生物玻璃支架材料的体外细胞相容性。方法溶胶-凝胶法制备A/W生物活性微晶玻璃（4006材料），熔融法制备多孔生物活性玻璃（45S5材料）。体外诱导分离培养及鉴定兔骨髓基质细胞（BMSCs），通过材料浸提液细胞毒性实验（MTT法）、细胞黏附实验、倒置相差显微镜、扫描电镜和环境扫描电镜比较4006材料和45S5材料对BMSCs细胞黏附和生长的影响，并探索与材料复合的最佳BMSCs细胞悬液浓度。结果4006材料浸提液培养1d时，其细胞活力与纯培养液间无统计学差异（P>0

2、.05）；但培养3d后，其细胞活力低于纯培养液（P　　有成骨性的兔BMSCs传代培养至第3～5代用于以下实验。1.4材料浸提液细胞毒性实验将同样规格大小的两种支架材料（4006、45S5）计算表面积后，按3cm2·mL-1的比例使用条件培养液浸泡，37℃下浸提28d，得到浸提液。取材料浸提液与条件培养液按比例配成100%（即纯材料浸提液）、50%、25%、12.5%、6.25%、0%（即纯条件培养液）的溶液。将BMSCs用胰酶消化后，制成5×105个·mL-1浓度的细胞悬液，接种入96孔板的72孔中，培养24h，待细胞稳定贴壁生长后进行下一步实验。用含不同浓度浸提液

3、的培养液替代96孔板中原纯条件培养液进行细胞培养，每种浓度各培养6孔细胞。培养的第1、3天，每种浓度取3孔，MTT法测定各孔的吸光度（D490），取均数。另测未放入细胞的纯材料浸提液（即空白浸提液）、未放入细胞的纯条件培养液（即空白培养液）的吸光度值作为校正用。将纯材料浸提液、纯条件培养液培养细胞得到的吸光度值，减去相应空白浸提液和空白培养液的吸光度，得到校正值，用校正值进行分析。1.5最佳复合浓度筛选试验在24孔板中分别放入已用条件培养液预湿过24h的4006材料和45S5材料，每种材料各12孔。预先制备好BMSCs细胞悬液，使其终密度分别为2×104、2×105

4、、2×106、2×107个·mL-1。用可调手动移液器将细胞悬液以每次10μL的量，逐次滴加到材料上，直至材料饱和而没有含细胞的培养液流出为止，每种浓度每种材料接种3孔。置于37℃、5%CO2及100%饱和湿度的培养箱中，待细胞稳定黏附6h后再加入培养液，使材料完全被浸没，用量大约为每孔1.08mL，隔日换液。每日在倒置相差显微镜下观察细胞与材料的黏附情况。在复合第3天细胞已稳定贴壁黏附后，将复合有细胞的材料取出，移入另一48孔板的24孔中，加入条件培养液每孔500μL。MTT法测量两种材料上已黏附细胞的活力（吸光度）。具体操作如下。1）向已放入复合有细胞材料的24

5、孔中，加入MTT液每孔50μL，37℃、5%CO2及100%饱和湿度的培养箱中继续培养，让MTT液与材料上复合的细胞作用4h。吸去培养液，加入二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）每孔375μL。在微型振荡器上振荡10min。2）将48孔板放入酶标仪，在490nm的光波下测定细胞吸光度（D490）。每组3份样本，计算均数。3）将48孔板中测得的吸光度减去相应材料空白浸提液的吸光度，得到校正吸光度。对照1.3中所得到的细胞浓度-吸光度标准曲线，估算材料上细胞黏附的量。1.6BMSCs与生物材料复合后观察根据最佳复合浓度筛选试验的结果，选用2×107

6、个·mL-1浓度的细胞悬液以同样方法分别接种预湿好的4006材料、45S5材料。逐日使用倒置相差显微镜观察细胞生长及与支架材料的附着情况。在材料与细胞复合培养的第4、7天，进行SEM和ESEM检查，观察细胞在材料表面的附着生长情况。82结果2.1细胞浓度-吸光度标准曲线MTT法绘制的细胞浓度-吸光度标准曲线见图1。细胞的吸光度随着细胞浓度增加而增加。图1细胞浓度-吸光度标准曲线Fig1Standardcurveofcelldensitytotheabsorbance2.2材料浸提液细胞毒性实验纯材料浸提液和纯条件培养液培养细胞1、3d时的吸光度见表1、2。4006材

7、料浸提液培养1d时，其细胞活力与纯培养液间无统计学差异（P>0.05）；但培养3d后，其细胞活力低于纯培养液（P　　3讨论3.1支架材料应用于骨组织工程的无机材料主要是生物陶瓷类，生物活性微晶玻璃也称为生物活性玻璃陶瓷，其结构、性能和制备方法与玻璃和陶瓷都有所不同，但在性能上集中了二者的共同优点。Hench等[6]发明了部分降解含磷和钙的硅玻璃，其中一类具有特殊结构，称为生物活性玻璃（bioactive8glass，BG）。其表面部分在水溶液中可形成富含氧化硅和钙、磷离子的胶样层，有利于羟磷灰石的形成和沉积，然后羟磷灰石晶体可吸附胶原黏多糖和糖蛋白，从而在BG与