实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离.doc

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1、实验二　氨基酸的离子交换柱色谱分离【原理】本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸AsppI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸LyspI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。【操作】1、树脂的处理关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，

2、本实验采用处理好的树脂。2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方

3、可投入使用，否则要重装。3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分

4、即开始洗脱。注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡，并且在调节时不要过猛，以免影响色谱行为。5、收集：柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。6、改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12NaOH洗脱液，然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。7、测定：（注2）将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1mlpH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂，混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5～10分钟，加3m160％乙醇衡稀释，摇

5、匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。8、再生，对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/LNaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。注：1、对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/LNaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时用水先将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/LNaOH使树脂转成钠型（对于其它的转型要视实验和树脂

6、的情况而定），在蒸馏水洗至中性备用。2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1mlpH5.3的柠檬酸缓冲液。【器材】①玻璃色谱柱：长19cm，内径1.2cm，3＃砂芯。②恒流泵（微量输液器）。③Bs-160型部分收集器或以收度试管手工操作。④721型分光光度计。⑤刻度吸管、试管。⑥水浴锅。【试剂】①树脂：磺酸型阳离子交换树脂（732型）②洗脱液：0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液，取285克柠檬酸（C6O7H8·H2O）；186克97％NaOH；105ml浓盐酸溶于水

7、稀释至10升。0.01mol/LpH12NaOH缓冲液，取4克NaOH溶于10升蒸馏水。③样品液：0.005mol/LAsp和Lys的0.02mol/LHCl混合溶液。④显色剂三氯化钛——茚三酮溶液：醋酸缓冲液：水150ml，无水醋酸钠82克，无水醋酸25ml，加水定容250mlpH5.5。乙二醇甲醚750ml，加入茚三酮20克，三氯化钛（TiCl315%）1.7ml，用醋酸缓冲液定容到1升。