第七章-放射免疫分析技术和免疫放射分析技术上课讲义.ppt

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1、第七章-放射免疫分析技术和免疫放射分析技术基本原理：标记抗原和待测抗原（或标准品）对有限量的特异性抗体发生可逆的竞争结合反应，最终形成的放射性复合物与被测抗原含量呈负相关，所以也称为竞争性放射性免疫分析：Ag*+AbAg*-Ab+Ag-AbAg游离物(F)复合物(B)當Ab含量為有限定量，則當Ag，Ag-Ab，Ag*-Ab免疫放射分析技术（IRMA）：主要原理是一种标记抗体与有限量的抗原结合，剩余的未结合的标记抗体再与固相抗原结合而被分离。Ag+Ab*Ag-Ab*+Ab*=Ag-Ab*+Ag-Ab*固相當Ag，

2、則Ag-Ab*，故復合物Ag-Ab*濃度與Ag含量成正相關。Scatchard作图Scatchard于1949年对化学反应进行数学推导，以几何图形的方法叙述了化学反应到达平衡时，游离物与结合物相互间的参数，称之为Scatchard作图法。抗原抗体反应是遵循质量作用定律的，因此其反应式和数学推导，可沿用Scatchard作图法进行推导。对IRA法：FB式中，设[Ag]，[Ab],[AgAb]分别是抗原、抗体、抗原抗体复合物（B），k1为结合常数，k2为解离常数，K为反应到达平衡时的亲和常数。[Abt]为抗体总浓度，F

3、为游离物，B为结合物，B/F为两者比率，也称为竞争结合率。B/F对B作图，B为自变量，B/F为因变量，所得斜率为亲和常数K，x轴截距为[Abt]，y轴截距为K[Abt]，这就是Scatchard图。如图2.1。IRMA中抗原抗体反应，其本质与RIA一样，也服从质量作用定律，同样可从质量作用定律推导数学式，不同的是Ab表示标记Ab（即Ab*）。将上式展开代入上式在IRMA的反应体系中标记抗体是过量的，B值即为放射性活度，可直接用cpm数表示，为纵轴的单位，横轴与RIA一样是标准物的浓度，两者是正相关，而RIA却是负相

4、关，这就体现了IRMA标准曲线剂量反应范围比RIA大，灵敏度也可明显提高。3、剂量反应曲线Yalow以胰岛素为例，与抗体（两个结合1位点分别为Aba与Abb）相互作用，其反应曲线图2.2,将得到在这种情况下，B/F对B作图是一条曲线根据代入乘以得到剂量反应方程式标准曲线：标准曲线可由B/F对Agt作图，即为在放免分析中常用的标准曲线。通过未知样品的B/F值，便可从曲线上读出对应x轴上抗原浓度。现工作中常用B/B0来表示，然后通过数学模式来进行数据处理，可直接打印出求知样品的测值。IRMA的测量反应曲线是根据下式来作

5、图：式中，k和q是固定值，B随p增多而增大，二者呈双曲线关系，随着p的逐渐增大，q渐趋饱和，B渐近q，而曲线达到坪区，如图2.3。代入上式IRMA剂量反应曲线，随抗体量的增加，抗原量也需相应增加，标准线的斜率段也随之伸延，这就扩大了可测的剂量范围。一般RIA在剂量范围是二个数量级左右，IRMA可达到三个数量级以上。这时临床应用很有意义。例如TSH在甲亢症时，血中含量<1U/ml，但TSH-RIA的最小可测值为>1U/ml，而TSH-IRMA的灵敏度达到0.02U/ml，所以TSH-IRMA就更适合应用诊断甲亢症。又

6、如hCG，在血中含量低到<1U/ml，但在生理和病理情况又可增至>3000U/ml以上，这样要求标准线的剂量范围很大，才能适应临床。一般的RIA就要稀释标本来检测，而hCG-IRMA，其剂量范围为0.005~5000U/ml，这就完全适合临床要求了。二、放射免疫分析方法学指标1、灵敏度所谓灵敏度，一般用最小检出量来表示，但也有用零剂量的精密度来表示的。实际上无论用哪种方法表示，某种物质的RIA，总得表示出最小检测量，才能达到临床应用的要求。在RIA中，标准曲线的斜率反映其灵敏度，即刚好能与被测物浓度为零时区分开来的

7、量。而斜率与亲和常数K成正比。灵敏度的大小与K值有关，K值越大，灵敏度超高。IRMA的灵敏度同样决定于零剂量时的斜率，斜率同样和K成正比。IRMA的灵敏度要比RIA高。2、特异性在RIA中，特异性是指结合物与被测物的类似物交叉反应的程度。交叉反应越小，特异性越高。IRMA的特异性，由于IRMA是双位点夹心法，一种物质必须同时具备两个特异抗原决定簇与相对应的抗体反应，才能最后形成标记复合物。所以从理论上IRMA往往不易发生交叉反应，其特异性也就较高。但标记物是抗体，与类似抗原也存在交叉反应，仅是与RIA表现不同。在R

8、IA中，类似抗原竞争结合抗体，使B值降低，而IRMA中表现的类似抗原与标记抗体结合，是使B值升高。3、精密度无论RIA或IRMA，都是以精密度来衡量分析方法本身质量好坏的指标之一，亦称重复性。它是对分析方法的随机误差的描述，反映了用该分析方法对同一样品进行多次测定时，测定值的标准差（s）和变异系数（CV）来表示。标准差表示各个测定值与均值的偏离程度，偏离度越