ELISA试验基本步骤及材料和试剂教案资料.doc

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时间:2020-09-05

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1、ELISA基本步骤和主要试剂、材料注意:本步骤为间接ELISA步骤一主要步骤1包被取所要包被的物质,提前设计好所需浓度,根据包被孔数计算所需包被物的量,用包被液稀释至所需体积,分加至各孔中。包被条件:两种选择:一是将ELISA板直接置4℃过夜;也可以先置37℃孵育2小时再转入4℃过夜。2洗涤包被结束后弃掉包被液,用PBST进行洗涤,方法为PBST加满每孔,静置5-10min,弃掉洗液,重新加满,重复洗涤3-5次,最后拍干ELISA板等待下一步封闭。3封闭常用10%小牛血清,取第2步的ELISA板加封闭液至每孔,体积至少为所加包被液的

2、两倍。封闭条件也有两种选择:直接置于4℃过夜,或者置于37℃温育2-4h,具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。4洗涤封闭结束的ELISA板进行洗涤,方法同步骤2。最后拍干等待加入一抗。5加入一抗一抗即为你要检测的物质,一般加之前需要稀释,具体稀释倍数不同实验不同需要自己摸索。一抗样品一般用包被液稀释,稀释到所需浓度后加入到相应孔中。反应条件为37℃孵育2h。6洗涤具体同步骤4。7加相应HRP-标记的商品化二抗加相应的商品化HRP-标记的二抗(如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗),一般也用封闭液稀释,稀释倍数参考二抗说明书。将稀释

3、好的二抗加入各孔,37℃反应1-1.5h。8洗涤具体同步骤4。9显色常用OPD作为显色底物,但OPD致癌,也有用TMB作为底物,,这里只介绍前者。显色需要配置显色液,具体方法为:在步骤8进行到一半使配置显色液,为10ml底物缓冲液加0.015gOPD粉末(实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可),等待OPD完全溶解。待步骤8完成后取150ul3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀,立即将此显色液分加至ELISA各孔中。然后将ELISA板置于37℃反应约10min。10终止将ELISA板取出,每孔加终止液(2

4、mol/L硫酸溶液)终止反应,立即到酶标仪上读数(OPD为底物是读数波长为490nm,TMB为底物时波长为450nm)。二材料、试剂1ELISA板专用于EILSA的产品称为ELISA板,国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式,需要购买。常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料。注意:聚苯乙烯材料目前只有进口,特点是孔大,加满约300ul,此时实验中所加各试剂(包被液、一抗、二抗、显色液、终止液等)均为100ul体积。而聚氯乙烯多为国产,孔较小,加满约200ul,此时各试剂只需加50ul体积即可。2各试剂配制1)包被液(PH6.3的碳酸盐缓冲液

5、)无水Na2CO30.1696gNaHCO30.2856gSW100ml完全溶解至4℃,一周内使用2)PBST配方NaCl8.0gNa2HPO4.12H2O2.9gKCl0.2gKH2PO40.24gTW-200.5mlSW1000ml3)底物缓冲液Na2HPO43.682g柠檬酸1.02gDW200ml不需灭菌,4℃保存4)3%H2O230%H2O2100mlSW900ml5)显色剂底物缓冲剂10ml3%H2O2150ulOPD15mg其中H2O2最后加6)终止液浓硫酸:SW=1:8浓硫酸缓慢加入到SW中,并搅拌散热三注意事项1包

6、被所谓37℃反应,一般取一个37℃的水浴锅,在水面放一较大泡沫板,将ELISA板置于泡沫板上即可,其余步骤的37℃反应操作同此;整个ELISA过程中所有需要较长时间等待的步骤(包被、封闭、加一抗孵育、加二抗孵育)均需要将ELISA包起来再放入冰箱或水浴锅中,一般可直接用一次性EP手套套起来即可。2洗涤最常规的洗涤步骤是洗涤3次,每次间隔5min,具体实验可能会微调,洗涤次数可以3-6次不等,间隔5-10min不等;每次洗涤后要将ELISA板尽可能拍干后在进行下一步操作,尤其是每个洗涤步骤的最后一次洗涤要尽可能拍干,拍干可在纱布、吸水

7、纸上进行,也可以购买洗板机。3显色配制显色液时3%过氧化氢一定要最后加入,加入混匀后立刻分装到ELISA板中,即在加过氧化氢前要完全完成洗涤的操作;OPD一般在倒数第二次洗涤前加入,要留有约10min时间以确保OPD完全溶解。其他未尽事宜可查阅相关资料。PEP小学英语五年级下册第三单元检测卷(满分:60分考试时间:40分钟)Class(班级)________Name(姓名)________Mark(成绩)________一、Let'sfindout.找出不同类的单词。(8分)1.()A.oneB.twoC.secondD.three

8、2.()A.MondayB.NovermberC.DecemberD.February3.()A.twelfthB.twentiethC.secondD.twelve4.()A.birthdayB.Children’sDayC.Nat

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