第十一章高效液相色谱法ppt课件.ppt

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1、高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatographyHPLC第十一章主要内容11-1概述11-2基本理论11-3高效液相色谱分离方法11-4高效液相色谱仪11-5高效液相色谱应用§11-1概述高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200μm重力或低压泵很慢3-10μm高压泵快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:>20h经典柱色谱HPLCt分离：1h§11-2基本理论一、色谱柱柱效的

2、基本关系式二、分离度GC基本理论（塔板、速率）也适合于LC三、速率方程溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一A涡流扩散项B/u分子扩散项Cu传质阻力项流动相流速对板高的影响小颗粒填料，填充均匀；选择较低的流动相流速；选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：提高柱效途径§11-3高效液相色谱分离方法一、吸附色谱法（液固吸附色谱LSC）1.分离原理Kad值越大，保留时间越长吸附平衡常数吸附竞争X：组分分子S：流动相分子2.固定相硅胶－强极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性分子筛－强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂应用最广硅胶表面结构

3、弱酸性，对碱性化合物强保留，拖尾硅胶表面结构经热处理发生的变化3.流动相(洗脱剂)越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能溶剂强度参数吸附竞争溶剂极性例:硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的组成可改变分离的选择性4.应用具有不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：邻位<间位<对位邻硝基苯胺间硝基苯胺对硝基苯胺适合

4、分离的物质二、分配色谱法（液-液分配色谱LLC+键合相色谱）LLC分离原理K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关固定相极性>流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱固定相极性<流动相极性组分极性越小，保留时间越长分离强极性物分离弱、非极性物☺三、离子交换色谱法（IEC）阳离子交换阴离子交换阳离子交换树脂1.分离原理组分对交换剂亲和力不同2.固定相阳离子：－SO3H(强)－CO2H(弱)阴离子：－N+R3(强)－NH2(弱)基质合成树脂纤维素硅胶离子交换剂3.流动相水相缓冲液+有机改性剂（甲醇、乙醇和乙腈）调节选择性的主要参数盐种类及浓

5、度pH值各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快4.应用离子型化合物、可离解的化合物、带电荷的物质等。如无机盐、生物大分子氨基酸、核酸、蛋白质等四、化学键合相色谱采用化学键合相的液相色谱固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点分配色谱：液液色谱+键合色谱1.键合固定相制备ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性硅烷化反应使用pH范围：2～8键合固定相类型1.疏水基团：烷烃（C8和C18）、苯基等2.极性基团：丙氨基、氰乙基、氨基、醚和醇等3.离子交换基团：

6、胺基、季铵盐、磺酸、羧酸2.键合相色谱法分类反相键合相色谱:常用固定相：C18分离对象非极性中等极性化合物常用流动相甲醇-水乙腈-水反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性<流动相极性正相键合相色谱固定相极性>流动相极性离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基键合相二醇基键合相保留时间：<例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸3,4-二羟基苯甲酸

7、固定相:非极性流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸<没食子酸五、尺寸排阻(凝胶)色谱法SEC、GPC相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离1.分离原理（Size-ExclusionChromatography）2.固定相是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。凝胶3.流动相不采用改变流动相组成的方法控制分离度凝胶色谱主要分离高分子化合物，常用流动相：四氢呋喃、甲苯、二氯甲苯、二氯乙烷、氯仿、丙酮等；分离生物物质时主要用水、缓冲液、乙醇、丙酮等。★分离方法的选择§11-4高效液相色谱仪WatersUPLC

8、超高效液相色谱仪高压泵流