小麦抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定.docx

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1、小麦抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定1，获取目的基因(试剂盒法)（TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性）（1）样品处理：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置于1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置5min 。  （2）加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s，静置 2min 。 （3）4℃ 离心， 12000g×15min ，取上清。（氯仿抽提蛋白，异丙醇沉淀RNA

2、，乙醇洗涤） （4）加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。  （5）4℃ 离心， 12000g×10min ，弃上清。  （6）加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min ，弃上清。 （7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥； （8）用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。（不含水的RNA酶溶解RNA沉淀）2，设计引物（长度一般为16-30bp，最佳为20-24bp，两个引物间不应发生互补避免形成引物二聚体）目标序列中酶的识别位点，(用DNMAN找出目标序列中的酶的识

3、别位点)AluI,AlwI,BssHII,CfoI,EcoRI,HaeIII,HhaI，HpaII，MboI,NarI，NcoI，NheI，PstIRsaISalI,Sau3A,SphI,StuI,TaqI,HindIIIBamHI（在引物的5’端添加限制性内切酶的识别位点及保护碱基方便克隆）（先找出序列中的启动子ATG和终止子TAG）（特定的酶有特定的保护碱基）Up5’-CCCAAGCTTATGCAGTAGCCATCT-3’（CCC为保护碱基）（ATG启动子）（上游引物）Down5’-CGCGGAT

4、CCCTACACCAAGAATTC-3’（CGC为保护碱基）（TAG为终止子）（下游引物）（在进行PCR时需要确定具体参数，其中退火温度对扩增影响最大，而退火温度取决于引物的TM值，所以要确定ＴＭ值，退火温度掌握不好会发生非特异性结合，降低PCR产物的对模板的忠实程度）1gcagcatttttatgcagtagccatcttctcctcctcctccccccgccttccagctagcca61cctagctcactatcacatcatccagcagcccacaccaactcatattgattccgttcccac121ctgctcgc

5、catcgccagccatgccaatgggcagcagcgccgccatgcccgccctccctcc181cggcttccggttccaccccaccgacgaggagctcatcgtccactacctccgcaggcaggc241cgcgtccatgcccagccccgtgcccatcatcgccgaggtcaacatctacaagtgcaaccc301atgggacctccccggcaaagctttgttcggggagaatgagtggtacttcttcagcccccg361ggatcgcaagtaccccaacggcgcg

6、cgcccgaaccgcgccgccgggtccggctactggaa421ggccaccggcaccgacaaggccatcctgtccacgccggccaacgagagcatcggggtcaa481gaaggcgctcgtgttctacaggggcaagccgcccaagggcgtcaagaccgactggatcat541gcacgagtaccgcctcaccgcagccgacaaccggaccaccaagcgcagaggatcctccat601gaggctggatgactgggtgctgtgtaggatccacaagaagtg

7、cggcaacttgcccaactt661ctcctcctctgaccaggaacaggagcatgagcaggagagctccaccgtggaggactcgca721gaacaaccacaccgtgtcgtcgcccaagtccgaggccttcgacggcgacggcgacgacca781cctccagttgcagcagttccgccccatggcgatcgccaagtcgtgctccctcaccgacct841gctcaacaccgtcgactacgccgcgctctcgcacctcctcctcgacggcgccggcgcct

8、c901gtcgtcggacgccggagcagactaccagctgcctcccgaaaacccactcatctactcgca961gcctccatggcaacaaacgctacactataataacaacaacggctacgtga