行业标准：GBT 27637-2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS11．220B41羁雪中华人民共和国国家标准GB／T27637--2011副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法Real—timePCRmethodforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp．p口r口‘H6ercHZosis2011-12-30发布2012-04—01实施宰瞀鹊紫瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仪19刖昌GB／T27637--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／Tc181)归口。本标准起草单位：中华

2、人民共和国广东出入境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：刘中勇、陈茹、杨国海、高云航、曾碧健、朱道中、吴晓薇、高小博。1范围副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB／T27837--2011本标准规定了副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubsp．paratuberculosis)实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测培养物、血样、奶样、粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，

3、仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T6682--2008分析实验室用水规格和试验方法GB194892008实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。DMSO：dimethylsulfoxide，二甲基亚砜。EDTA：ethylenediaminetetraaeeticacid，乙二胺四乙酸。PBS：phospha

4、tebuffersolution，磷酸盐缓冲液。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。Taq酶：TaqDNA聚合酶。UDG酶：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶。4原理本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA的引物，和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5’端标记了被称为报告基团的荧光素，3’端标记了淬灭基团。在进行PCR延伸反应时，Taq酶的5’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使其与淬灭基团分离

5、，从而仪器能检测到5’端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测到的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板，设计特异扩增引物和探针建立荧光PcR反应体系。5材料与试剂5．1仪器与耗材5．1．1接种棒。GB／T27637--20115．1．2无菌注射器或真空采血管。5．1．3灭菌容器。5．1．4橡胶管。5．1．5刮匙。5．1．6荧光PCR仪。5．1．7恒温水浴锅(室温至100℃)。5．1．8离心机(最高离心力达

6、15000×g以上)。5．1．9混匀器。5．1．10冰箱(2℃～8℃，--20℃，一80℃)。5．1．11天平(精密度达千分之一以上)。5．1．12微量可调移液器(i0pL，100pL，1000pL)。5．1．13微量带滤芯吸嘴(10pL，100pL，1000pL)。5．1．14研钵。5．1．15离心管。5．1．16PcR光学反应管。5．2试剂5．2．1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB／T6682--2008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5．2．2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制

7、成100pmol／L储存液，置～20℃或更低温度冻存；使用时取适量配制成10pmol／L工作液，避免多次冻融。上游引物：5'GTCAGCGGCGGTCCAG3’，下游引物：5’GcAGCTCCAGATCGTCATTc3’，探针：5LFAM—ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC3’BHQ-1。5．2．30．01mol／LpH7．6PBS：配方见A．1。5．2．4柠檬酸钠缓冲液：配方见A．2。5．2．50．5mol／LEDTA：配方见A．3。5．2．6柠檬酸钠一磷酸缓冲液：配方见A．4。5．2．74％氢氧化钠溶液：配方见

8、A．5。5．2．84％硫酸溶液：酉已方见A．6。5．2．9TritonX一100。5．2．10DNA提取液：含100mmol／LTris-HCl(pH8．o)，0．01％TritonX一100，200pg几L蛋白酶K。也可采用等效商品化试剂。5．2．11灭菌双蒸