猪链球菌的分离、16SrRNA鉴定及药敏实验-论文.pdf

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1、南亩放墨廛罾匡嘲·猪病防治2014年第3期(总第181期)doi：l0．3969／j．issn．1006—4907．2014．03．010猪链球菌的分离、16SrRNA鉴定及药敏实验傅学才(湖南省娄底市娄星区畜牧水产技术服务中心，湖南娄底417000)摘要：从湖南娄底某猪场病猪组织中分离出6株细菌，通过培养特性、细菌染色镜检、16sRNA基因扩增及序列BLAST分析等系统鉴定，确定为猪链球茵。并对分离茵与GenBank中收录的l7株猪链球菌的16SrRNA基因序列的进行同源性比对．结果显示，6株分离茵的16SrRNA基因序列与收录茵株同源性为99％以上。药物敏感试验表明．分离细菌对头孢类、13

2、内酰胺类药物高度敏感、对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类药物产生耐药。而6株分离细菌对氯霉素类药物的敏感，但敏感性有差异。关键词：猪链球菌，16SrRNA基因，药物敏感实验中图分类号：$856．28文献标识码：A文章编号：1006—4907(2014)03—0021—02猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传沸10min，冰浴后离心取上清夜做PCR反应的模板。染病，可致猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多1．4．2对分离菌进行PCR鉴定发性浆膜炎。临床表现为急性出血性败血症、哺乳按MakinoS的方法设计猪链球菌16SrRNA仔猪下痢和孕猪流产等，可致生猪死亡，危害较严(M23728)P

3、CR引物。上游引物P1：重。据报道血清型众多，日前有35个血清型，而且5’一ACGCGTAGGTAACCTGCCTC一3’，下游引变异频繁。笔者在湖南娄底某猪场剖检了疑是猪物P2：5’一GCCATI’GTAGCACGTGTGT一3’。扩增链球菌病的生猪2头，从采集的组织样中分离出6片段理论长度为1130bp。反应体系(50L)：10x株细菌，通过细菌形态学、16SrRNA等系统鉴定，Taqbufer5．0IXL，dNTPs(2mmo]／L)5．0L，MgC12确定为猪链球菌。现将结果报告如下。(20mmol／L)3．0L，上下游引物(20Pmol／L)1材料与方法各2．0L，TaqDNA聚合酶

4、(2U／L)1．5L，模板1．1试验材料2．5L，灭菌双蒸水29．0L。反应程序：94℃预变湖南省娄底的两个猪场采集的三元仔猪2头性2rain；94oClmin，56oC2min，72oC2rain，30个和6份病料。鲜血琼脂、巧克力琼脂购自江门市凯循环；72℃延伸7rain。1．0％琼脂糖凝胶电泳检测林贸易有限公司。即用型PCRMix试剂盒购自北PCR产物，在凝胶成像系统下观察结果。京天恩泽基因科技有限公司，药敏纸片分别购自1．4．3测序上杭州微生物试剂公司PCR产物送上海生工测序，测序结果进行1．2细菌分离BLAST比对。将采集的组织病料在超净工作台内接种于鲜1．5药敏试验血琼脂培养基、巧

5、克力琼脂培养基，于37~C培养选择鉴定猪链球菌的菌株培养液涂布接种于24h，观察细菌菌落形态特征，挑取疑是猪链球菌鲜血琼脂平板，在无菌操作条件先将将药敏试纸的菌落进行纯培养。片平贴于培养基表面，37％培养箱培养24h，测量1．3细菌染色镜检其抑菌圈直径。挑取疑是猪链球菌纯培养菌落涂片，进行革2结果兰氏染色、显微镜下镜检，观察细菌形态特征。2．1细菌特性1．4细菌PCR．检测和测序2．1．1从采集的病猪组织样品中分离到13株细菌，1．4．1细菌基因组DNA的提取其中6株出现OL溶血现象。用煮沸方法提取细菌DNA模板，离心过夜培2．1．26株出现溶血现象细菌染色镜检为呈链养菌液，加入150LTE缓

6、冲液混均后，沸水中煮状排列的革兰氏阳性球菌(见图i)。HunanAnimalscienceandVeterinaryMedicine，No．3，2014．(TotalNo．181)21南放房廛冒匣嘲·猪病防治2014-+-g3期(总第181期)鬟：≥豢≮舅蓑图2分离菌株16SrRNA基因PCR鉴定结果(注：2-4，6-7为病猪组织样品分离菌株，1为阴性对照2．2PCR鉴定8为阳性对照；5，9为DL+2000Marker)分离菌株的PCR扩增产物为1130bp大小的片段，与预期目的片段相符(见图2)。的16SrRNA基因序列同源性均大于99％，2．3同源性比对16SrRNA基因进行PCR扩增(图

7、3)。对分离菌采用169rRNA的引物对其可变区2．4药敏试验基因进行克隆、测序和同源性比对，并用BLAST软分离菌株对头孢头孢噻肟、先锋霉素、青霉素高件分析其同源性。结果表明，此6株菌株通过同源度敏感，对复方新诺明、链霉素、强力霉素、阿奇霉性比对，与GenBank数据库中收录的17株链球菌素耐药，对氨苄西林、恩诺沙星、氟苯尼考的敏感性6株菌有差异。结果见表l。熄0：嚣冀琵叠

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