广西金柑黑点病病原菌形态学及分子生物学鉴定-论文.pdf

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1、38中国南方果树2014年第43卷第4期广西金柑黑点病病原菌形态学及分子生物学鉴定阳廷密，刘冰浩，邓明学，门友均，娄兵海，覃旭，张素英，邓光宙，区善汉，陈贵峰，唐明丽，王明召，甘海峰(1广西柑桔生物学重点实验室／广西柑桔研究所，广西桂林，541004；2广西亚热带作物研究所)摘要：近年广西金柑黑点病发生呈逐年上升趋势，为鉴定广西金柑黑点病的病原，从广西阳朔县和融安县1O年生金柑上采集黑点病组织样品，按柯赫法则获取病原，采用形态学方法时病原进行初步鉴定，然后采用rDNA-ITS系列分析技术及系统发育分析方法对其进一步鉴定。结果表明，金柑黑点病分离痛原真菌为柑桔间座壳菌Diaport

2、hecitri(无性态为Phomopsiscirri)。关键词：金柑黑点病；柯赫法则；rDNA-ITS；柑桔同座壳茵Diaporthecitri中图分类号：S436．661．1文献标识码：A文章编号：1007—1431(2014)04—0038—03近年来广西各金柑产区不同程度发生了黑点病嫁接容器苗及3年生田间栽培苗。接种后覆盖薄(金柑果面和叶面出现黑点症状)。目前，尚未见有膜，翌日早晨掀膜，此后进行正常管理。待嫩叶发病关金柑黑点病的研究报道。为探明金柑黑点病的病后按“1．1”方法进行病原菌的再分离。原，笔者开展了本研究。1．3病原菌的分子鉴定基因组DNA的提取：分离菌株在PSA

3、上纯培1材料与方法养2O天后，将菌丝从培养基上刮下，采用CTAB法1．1病原菌的分离与纯化提取菌株基因组DNA。在广西阳朔县白沙镇和融安县大将镇1O年生rDNA-ITS序列PCR扩增：采用通用引物ITS1金柑植株上，采集带黑点病典型症状的病枝、病叶和(5’一TCCGrAoGTGAACr(G(、广3’)和IT(5’一病果。用组织分离法[1]在病健交界处剪取2mrnX2，I、=)[CCoCTTArGATA髓3’)进行PCR扩ITIITI组织块，依次在75酒精消毒5秒，0．1升汞增。反应体系为2×PCRBuffer12．5“L(包含0．1U分别消毒2O秒、3O秒、4O秒、5O秒，无菌水

4、中连续TapPolymerase／／~L，500mmol／LdNTP，20retool／漂洗3次，取出病斑朝下置马铃薯蔗糖琼脂培养基LTrisHCl，100mmol／LKCl，3mmol／LMgC12)，10(PsA)平板上，于(26±1)℃暗培养。待培养基长／~mol／L的I和ITS4引物各0．5L，模板DNA出菌落后，挑取菌落边缘少许菌丝接种到另一PSAlp．L，最后加ddH2O补足至25L。反应条件为94平板上，于(264-1)。C暗培养。重复操作，直至获得℃预变性3分钟一95℃变性1分钟，54℃退火4O纯培养物。秒，72℃延伸4O秒，34个循环一72℃延伸1o1．2分离物

5、的反接与再分离分钟。纯化菌株在PSA上培养2O天后，用清水洗下rDNA-ITS序列测定和分析：委托上海生工生菌丝及分生孢子，配成孢子悬浮液。在柑桔新梢长物工程有限公司进行测序。通过NCBI在线工具到3～5cm嫩叶未展时，于傍晚雨后用孢子悬浮液BLASTn，将获得的rDNA-ITS序列与GenBank数均匀喷雾接种。接种日期分别为2011年6月9日据库中的核酸序列进行同源性分析。运用Clust—和2013年3月27日，接种对象分别为1年生脱毒alW软件对本研究获得的序列和6个参照序列进行收稿日期：2013—08—08；修回日期；2014一o4—12基金项目：广西柑桔生物学重点实验室

6、项目(桂柑科201201z003和桂柑科2013OlXOlO)；国家现代农业产业技术体系广西柑桔创新团队桂林柑桔综合试验站建设项目资助。作者简介：阳廷密，女，农艺师，主要从事柑桔病虫害防治研究。E-mail：njauouyang@126．corn中国南方果树2014年第43卷第4期richinensis)[的rDNA-ITS序列进行系统发育分析3结论与讨论的结果显示，金柑黑点病分离菌株jinganheidianbing与D．citri形成一个单独的分支，D_citriasiana和针对广西金柑黑点病，按柯赫法则获取病原，首D．citrichinensis则各自形成独立分支(见图8

7、)。由先采用形态学方法对病原进行了初步鉴定，然后采此推断，金柑黑点病分离菌株为D．citri。用内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer，ITS)序列分析技术L6]及系统发育分析方法对菌种作进一Mark空白分离株步的鉴定。鉴定结果显示，近年广西金柑果面和叶面上发生的黑点病的病原为柑桔间座壳菌Dia—porthecitri。2000bp—一柑桔间座壳菌Diaporthecitri(无性态为柑桔1000bp-—750bp。．+拟茎点霉Phomopsiscitr