bcg培养及cfu检测方法.doc

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1、BCG培养及CFU检测方法1•准备7H9液体培养基•在450mldH2O溶解2.35g7H9粉末•力[]1mL甘油,混匀•灭菌，冷却完全•按1:9比例加入OADC•在室温喑处储存培养基•不用培养基可以储存超过一个月。•用之前，加Tween80（过滤消毒），终浓度为0.01%（0.22um滤筛，针管,棕色管）•补充。此吋培养基可以过滤消毒或者直接使用。已经加了补充物和吐温的应该在4°C储存，并在儿周内使用。2.在20毫升7H9液体培养基在T75瓶中，重悬一小瓶冷冻的1毫升（450m订lion）MTBorBCG（存储在15%甘油和85%7H9液体培养基），在无C0?

2、的培养箱37°C加湿培养5-14天。用M7H9液体培养基（1ml）将BCG干粉打散混匀，一、液体培养基培养（加玻璃珠）1•接种适量（500ul）BCG至!J4mlM7H9液体培养基中,160rpm慢摇大约30天，直到有乳口色浑浊出现。（枪、枪头）2•将4ml培养基平均分（2ml）到两个锥形瓶（规格）中继续慢摇，直到什么时候?3•摇起来以后，如何保存？二、固体培养基培养1・取适量BCG（500ul）涂到M7H11固体琼脂平板上，置于37度，两星期后观察菌落的出现。2•将菌落刮到M7H9肉汤培养基（体积）中,160rpm慢摇，直到白色浑浊出现。问题：1.CFU测定取

3、适量摇好的BCG（107ml,计数范围在5—200个，按需要做梯度稀释，每个稀释梯度需要三个板）涂在M7H11固体琼脂板上，37度，（有无CO2?）,放置一个月，计数2.菌摇好后，用不加吐温的M7H9培养基重悬，即可感染细胞。3.感染方法：铺THP-1细胞后，根据所需MOI加入相应病毒量，3h后，用卩BS洗去多余病毒（离心），用1640培养基继续培养，20h后检测细胞坏死。4•结核分枝杆菌发生污染是什么现象？要如何鉴定？2.每五天检测0D600,知道0D600达到2.0（在什么地方取菌，检测）2.通过不同的细菌悬液的计数得到可行的MTB/BCG3.在Middle

4、brook7H11琼脂稀释板上，加0ADC,在两周后计数菌落，计算细菌浓度（不知道涂板量）。Middlebrook7H11琼脂平板制作:•在900mldH2O溶解21g7H11粉末•加5ml

5、

6、-油，涡旋以达到温和的悬浮。如果有必要，可以煮沸以充分溶解粉末•121°C高床灭菌15min•当培养基冷却至

7、J50-55°C的时候，加100mLMiddlebrookOADCEnrichment和2.5ml20%Tween80（过滤灭菌），混匀并倒入琼脂板。•注：需购买MiddlebrookOADCEnrichments7H11粉末4.通过室温下自旋，6000g7分钟，

8、收获细菌。