细胞活性测定方法介绍和使用探讨.doc

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1、1.细胞活性测定方法介绍和使用探讨细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、3H射性同位索掺入法、MTT法等。其屮MTT法以其快速简便，不需要特检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应,但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由寸去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan,故有时重复性略差。了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮呼盐类：女IXTT、CCK-8(WST-8)等。现就这三种四氮哩盐类方法作一个简单介绍：1、MT

2、T法MTT：化学名：3-(4,5-二甲基嗟哇-2)-2,5-二苯基四氮呼漠盐，弟名：噬呼蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性'还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲(Formazan)并沉积在细胞屮，而列胞无此功能。二甲基亚枫(DMSO)能溶解细胞中的甲，用酶联免疫张仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一完胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性计以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏

3、度高、经济。缺点：由于MTT经还原所产生的甲产物不溶于水，需被溶解后才能检;这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产牛影响，而且溶傩的有机溶剂对实验者也有损害。2、XTT法XTT：化学名：2,3-bis(2-methoxy-4-nitro—5一sulfopheny1)一5一［(phenylamino)carbon;-2H-tetrazoliumhydroxide,作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活纠1.细胞复苏方法1.从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化

4、而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。2.迅速放入盛有36°C~37°C水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。3.剪开纱布口袋，取出安剖，用70%酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。4.低速离心（500-1000转/分）5分钟，取上清后再重复用培养液漂洗、离心。5.加入培养液适当稀释后，再移装入培养瓶中，置温箱培养，次FI更换一次培养液后再继续培养。3•细胞冻存方法1・细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。2•

5、计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数,令细胞密度达5X1O6/MI,离心去上渚，吸入离心管中。3•冻存液：先用培养液9分+DMSO1分（或甘油）配成10x的DMSO冻存液，按上法一備滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。4•分装：分装入无菌安剖中，毎安剖加1.5毫升细胞悬液。5•封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查>定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中>以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，

6、注明：细胞名称，冻存日期>以便日后查找。4.常规组织培养法1）初代消化培养法1.准备：取各种己消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2•布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3•处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2飞次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。4•剪切：用眼科剪把组织切成2飞毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶II或塞以胶塞

7、。5•消化：或用恒温水浴，或置于37°C温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6•分离：在消化过程屮见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织己分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500〜1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7•计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细

8、胞来说，pH要求在7.2~7・4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC03调整。8•培养：置于36.5°C温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需耍换新塞。2）初代组织块培养法1・剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。1.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每