大豆凝集素单克隆抗体的制备及鉴定-论文.pdf

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1、中国畜牧兽医2012年第39卷第9期生物技术·79·大豆凝集素单克隆抗体的制备及鉴定张海全，车东升，刘飞飞，穆成龙，谷琳琳，孙泽威，秦贵信(1．吉林农业大学，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118；2．吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)摘要：为获得分泌抗大豆凝集素(SBA)~3g隆抗体的杂交瘤细胞，以纯化的SBA为抗原，免疫BAIB／c小鼠，加强免疫3d~lRd'鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2／0)融合，应用有限稀释法和间接EIISA方法克隆筛选出2株分泌抗SBA单克隆抗体的杂交瘤

2、细胞系A7、F12。细胞上清抗体效价均在1：2×10。以上，腹水抗体效价均为1：1×10，单抗亚型鉴定结果均为IgG2b型，分子质量为189．6ku，亲和常数为7．1×10mol／L，Westernblotting结果表明，2株单抗具有较高的特异性。该McAb的制备为建立SBA定量检测方法奠定了基础。关键词：大豆凝集素；单克隆抗体；制备；鉴定中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1671—7236(2012)09—0079—03大豆含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸，是人的抗体是自制的多克隆抗体，影响测定的稳定性。类和

3、畜禽优质的植物性蛋白质源(Hancock等，本试验以高纯度的SBA为抗原，免疫小鼠，制备高2000)。但是，大豆中含有多种抗营养因子在很大程特异性的单克隆抗体，为建立快速、特异、稳定的度上限制了其在畜禽生产中的应用。大豆凝集素是SBA抗原检测方法和为中国开发研制SBA检测试大豆中主要的抗营养因子之一。SBA作为一种抗剂盒奠定基础。营养因子能与肠道上皮细胞结合，使肠道上皮组织1材料与方法受损，通透性改变，外源蛋白或病原微生物可直接进1．1SBA抗原的制备以半乳糖胺一Sepharose一入体内，引发过敏或炎症反应(Coke

4、等，1985)；SBA6B为亲和层析体系，生理盐水为缓冲液，用含I)h半能刺激肠细胞增生和分泌，使肠壁增厚，增加内源蛋乳糖的缓冲液为洗脱液对SBA进行纯化，并对纯化白的损失(Schulze等，1995)；且凝集素本身不易被的SBA进行透析、浓缩、鉴定、冻于保存，以此作为消化酶水解。因此准确的检测食物或者饲料中单克隆抗体的抗原和凝集素检测ELISA的标准品。SBA的残留对动物生产和人类健康具有重要的意1．2免疫程序用纯化的SBA免疫8周龄义。目前国内外关于SBA的检测方法基本上分为BALB／c小鼠，免疫剂量为8Og／只，

5、免疫途径为颈红细胞凝集反应及其改进方法和免疫测定法(Lie—背部皮下多点注射，共免疫4次，每次问隔3周。第net，1995；Grant等，1983；Miller等，1998)。凝集反1次抗原加等量弗氏完全佐剂，第2次抗原加等量应检测不到SBA的免疫活性，而免疫测定法所使用弗氏不完全佐剂，第3次免疫同第2次，10d后采血，测定小鼠血清效价，融合前3d做加强免疫，8O收稿日期：20l2一O229gg／只，不加佐剂抗原腹腔注射。作者简介：张海全(1986)，男，吉林人，硕士生，主要从事动物1．3筛选方法的建立本试验采用方阵滴

6、定法，根营养与饲料科学研究。据阳性血清D值在1．0左右，P／N(阳性D伽通信作者：秦贵信，教授，博士生导师。Email：guixin@public．值与阴性D值比)最大时的抗原包被浓度、抗体CC．J1．cn基金项目：围家自然科学基金项目(30871802)。稀释度为最佳包被浓度、最佳稀释度。samplewereevaluated，sexwasidentifiedwithdirectwholebloodPCRamplificationandcomparedwithgonadalSexin62of1-day—oldchic

7、klings，80of12一dayoldand8Oof16一day-oldchickenembryos，respectively．Theresultsshowedthatsexidentif／cationwithdirectPCRamplificationwith0．1LwholeBloodsamplewasfullyconsistentwiththegonadalsex，thereforeitwasaccuracyinchicklingsandchickenembryos．ACD，heparinorDETAcould

8、beadoptedasanticoagulantandbloodsamplescouldbestoredat4，一20or一8O℃for3monthsatleast．Comparedwithconventiona1PCR．thedirectwholebloodPCRcouldbeeconomic，efficientand1OWpo