土壤放线菌的培养与观察.doc

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1、土壤放线菌的培养与观察一、实验目的1.学会选择放线菌采样点并合理取样；2.掌握高氏一号培养基的配制方法；3.学习分离纯化放线菌的基木操作技术，掌握微生物培养方法以及接种技术，学会放线菌纯培养的确定；4.学会使用高压熬汽火菌锅、显微成像系统等实验仪器设备；5.培养并学习微生物实验的一般思维及方法。二、实验原理放线菌是指能形成分枝或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌，主要的分布源是土壤，链霉菌是其优势菌群。十.壤是微生物生活的大木营，它所含微生物无论是数量还是种类祁是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性分布的重要场所，是

2、发掘微生物资源的重要基地，可以从屮分离、纯化得到许多有价值的菌株。木实验将采用高氏1号培养基从土壤屮分离放线菌。三、实验器材1•高氏1号培养基的配制：试剂：可溶性淀粉：20g,KN03：lg,NaCl：0.5g,K2HPO4・3H2O：0.5g,MgSO4*7H2O：0.5g,FeSO4*7H2O：O.Olg,琼脂：20g,水：lOOOmL,pH试纸（调节至7.2—7.4）。方法：先用少量水将淀粉溶入烧杯屮，搅拌至完全溶解，再依次加入其他成分进行溶解，最后加水至lOOOmLo调节pH7.2〜7.4,加入琼脂

3、，搅拌至完全溶解。待用。2.仪器及其它用品小铲，25,mL三角锥形瓶，250mL烧杯，药勺，无菌培养皿，剩9inL无菌水试管5支，盛45mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃珠，接种环，酒精灯，称量纸，高压蒸汽灭菌器，超净工作台，培养皿，移液器，分析天平，恒温震荡仪，微波炉显微成像系统，。四、实验步骤与方法1.土壤取样放线菌主要分布在十壤中，研究表明，原生林等原生环境中放线菌的多样性很丰富，另外,在极端坏境如高盐、要酸碱、高低温、高辐射等地方也存在许多未知的放线菌。rti于条件的限制，木实验取学校体育馆

4、附近原生林土壤（树木下）作为土样。2.仪器灭菌将培养基溶液的三角瓶用报纸包扎好、试管、三角锥瓶，玻璃珠放到高压灭菌锅进行高温蒸汽灭菌。3.制备土壤稀释液称取土样5g,放入盛45ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶屮，用震荡仪恒温振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散，即配制成10-1±壤溶液。用一支lml无菌吸管从屮吸取lml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管屮，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支lml无菌吸管从此试管中吸取lml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-3.10-4备种稀释度

5、的土壤溶液。4•培养基的制备（1）倒平板将配制好的高氏1号琼脂培养基于高压蒸汽灭菌锅屮高温消毒灭菌，待冷却至55—60°C时,往高氏1号培养基屮加入1ml的0.5%重铮酸钾，然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平1111并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养1111盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约I5ml,加盖后轻轻摇动培养111L,使培养基均匀分布，平置于桌血上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个

6、平行样品）。（2）取样在6个平板底面分别用记号笔写上10-3和10-4两种稀聲度，然后用3支1ml无菌吸管分别由稀释度为10-3和10・4土壤稀释液屮吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板屮，各加入儿个已灭菌的玻璃珠，轻轻晃动，涂布均匀，然后将玻璃珠取出。将平板倒置于28°C恒温室中培养7Uo不要用ImL吸管每次吸取0.2mL稀释菌液到平板屮，这样容易加大同一稀•释度几个平行平板间的误差；（3）平板呦线分离法分离放线菌目的是通过划线将样品在平板上进行稀释，使Z形成单个菌落。将蘸有菌种的接种环在平板培养基上

7、做以Z字行划线,每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养川L盖，倒置与恒温箱屮培养。（4）用结晶紫对菌体涂片染色完成后，在显微成像系统下观察放线菌个体形态