两虫检测方法说明.doc

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1、隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的方法说明一、标准接种吸取2ml吐温-20稀释液（0.001%）加入标样管中，涡旋混匀后倒入乘有约1-2L纯水的广口瓶中，（标样共接种于10L水中，剩余水应在抽滤过程中分3次倒入）向标样管中加入3ml纯水，涡旋洗涤（并将标样管倒置，使管帽也被充分洗涤），将洗涤后标样管中的液体，倒入广口瓶中，重复5次。将广口瓶放置在磁力搅拌器上，并向其中投入磁力搅拌子。链接蠕动泵及过滤装置，开始过滤，流速控制在1-2L/min。（清洗容器应使用纯水，不要使用清洁剂）二、样品的淘洗和浓缩1.准备缓冲液在开始混合缓冲液前，首先确定有多少样品进行淘洗，根据样品量配制缓冲液。需要准备400ml纯

2、水用于淘洗设备的预冲洗，每个样品至少需要400ml缓冲液。PS:配置1升淘洗液：在容器中加入8gNaCl,0.2gKCl,2.9gNa2HPO4以及0.2gKH2PO4溶在0.9L的试剂级纯水中。调PH值到7.4。加0.1ml吐温-20溶液到容器中再搅拌10分钟。（注意：吐温-20溶液非常粘，应该用吸液管小心移出）2.转移到缓冲液瓶中缓冲液瓶包括一个10L瓶子和一个4L的瓶子，建议10L瓶子放淘洗液，4L瓶子用来盛放纯水。3.初始化的系统检测在样品淘洗前用纯水代替缓冲液进行操作，用于检测设备系统可否正常使用，并可对系统内部的管路进行冲洗。a.将一个未使用过的滤芯放入滤器中（这个滤芯如果只作为初

3、始化系统检测及清洗管路时使用，可重复使用一个月）b.完成样品淘洗过程的1-8步。c.在淘洗结束后将离心管里的液体倒掉。d.把滤器从淘洗设备中取下，然后把出口分流调节装置从滤器上取下。e.用70%的酒精擦洗QC干体。f.进行正式的样品淘洗。4.淘洗样品a.打开两虫淘洗设备的开关（开：电源开关——空气压力阀，关：空气压力阀——电源开关）打开空气压力泵。绿色的灯（显示电源）和红色的灯（显示设备处于准备状态）会亮。b.把500ml锥形离心管的盖子打开，并把它放到淘洗设备里的离心管支架上。c.把分流调节装置连接到滤器上的QF干体装置上。a.滤器的上端向下，把分流调节器放在离心管上，这时会有水从分流调节器

4、中流到离心管中。b.把滤器上的QC主体连接到两虫淘洗装置上的QC肢体上。c.确保缓冲液已经放在缓冲瓶中了。确保有插管的瓶盖盖到缓冲瓶上，且密封环完好，并把瓶盖拧紧。d.按控制面板上的F1键开始两虫淘洗过程。e.淘洗过程结束后，把滤器从淘洗设备上取下，然后把出口分流调节器从滤器上取下。f.把滤芯从滤器中取出，并丢弃（通常经过高压处理后再弃掉）。g.盖上离心管并从淘洗设备中取出。h.用酒精清洗QC干体装置。i.进行下一个样品淘洗。j.用纯水代替缓冲液清洗残留在设备内部管路中的缓冲液。如果超过一周不使用淘洗设备需将设备中的水排干，将瓶中的水倒掉，空抽一次。2.离心浓缩及转移浓缩液a.离心机应放在牢固

5、的工作台或地板上，尽量减少晃动。b.平衡对称的离心管，和适配器、离心桶一起平衡，重量差别不超过0.5g，尽量减少摆动。注意：如果离心管不被平衡则会产生额外的震动，影响到目标物的沉淀。c.设置离心机参数2000g，15min。样品在离心机中自然惯性停止，不可使用刹车系统急停。d.用真空泵或蠕动泵吸取离心管中的上清液，在进口处装一个移液枪头（如5ml枪头）以减少进口的真空力度。最终留取5-8ml（可预先在管上做好标记）。流速控制在200±20ml/min。注意把移液管放到液面中心，接近液面处上吸取上清液，以减少沉淀的损失。e.将离心管中的剩余的浓缩液在涡旋混合器上混匀20秒。f.用缓冲液润洗移液枪

6、将所有液体转移至L型试管中。（注意：移液枪头需要用缓冲液润洗下，是为了避免移液管壁因干燥而将两虫挂壁。）g.使用纯水清洗两次移液管（如剩余体积为7ml,则每次1.5ml）,并将清洗液移入同一个L型试管中，每次冲洗后都要我选20秒再移出液体。一、两虫的捕获★隐孢子虫/贾第鞭毛虫磁珠分选试剂盒：10XSLTM-BufferA，10XSLTM-BufferB,Dynabeadsanti-Cryptosporidium—隐孢子虫磁珠，Dynabeadsanti—贾第鞭毛虫磁珠。a.配制1XSLTM-BufferA溶液：向900ul蒸馏水加入100ul10XSLTM-BufferA。b.向L型试管内加入

7、1ml的10XSLTM-BufferA（10XSLTM-BufferA在0-4℃储存时可能会有结晶析出，使用前将其放置在室温下充分溶解）。c.向L型试管内加入1ml的10XSLTM-BufferB。d.将隐孢子虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管内。e.将贾第鞭毛虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管内。a.盖上L型试管盖，将其放置在DYNALMIX混合器上，