重组酿酒酵母催化二氢大豆苷元生产雌马酚-论文.pdf

《重组酿酒酵母催化二氢大豆苷元生产雌马酚-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2014，34(4)：41-45DOI：10．13523／j．cb．20140407重组酿酒酵母催化二氢大豆苷元生产雌马酚刘玉雪张神昕王磊林心萍朱志伟赵宗保(1中国科学院大连化学物理研究所生物技术部大连1160232中国科学院大学北京100049)摘要雌马酚是大豆异黄酮的代谢产物，是一种天然的选择性雌激素受体调节剂，稳定性和生物学活性高。为实现雌马酚的微生物合成，采用模块途径工程策略，构建编码雌马酚合成关键酶基因o4、orf-2和o,f-3的表达载体，成功用于转化

2、酿酒酵母BY4741，得到工程菌株。结果表明，工程菌株有效表达了外源基因，并可将大豆异黄酮代谢中间体二氢大豆苷元转化为雌马酚。为构建从头合成雌马酚的微生物细胞工厂提供了重要科学参考。关键词雌马酚二氢大豆苷元酿酒酵母生物催化中图分类号Q8l2大豆异黄酮与雌激素结构相似，能与OL、B两种雌前，人们已成功构建了合成大豆苷元、葛根素等异黄酮激素受体(estrogenreceptor，ER)结合，是一类天然的选类化合物的酵母工程菌株。最近，从成人粪便中分择性雌激素受体调节剂。据报道，大豆异黄酮可以离得到可转化大豆苷元至雌马酚的

3、细菌Slackiasp．用来预防一些与雌激素水平下降相关的疾病如妇女更strainNATTS，分离鉴定出3个关键酶ORF一3(IDN0．：年期综合症、乳腺癌症等，还具有降低胆固醇、调节血BAL46930)、ORF一2(IDNo．：BAL46929)和ORF一1(ID脂和延缓衰老等功效，且无明显毒副作用。No．：BAL46928)，完成了功能验证，即它们分别催化转雌马酚(equol，EQL)是大豆异黄酮的一种代谢产化大豆苷元到二氢大豆苷元(dihydrodaidzein，DHD)、物。研究表明大豆异黄酮的生物学功效在一

4、定程度上DHD到四氢大豆苷元(tetrahydrodaidzein，THD)和THD到雌马酚(图1)口。这些关键元件使构建微生物可能归因于雌马酚。雌马酚具有一对对映异构体的外消旋体化合物(s一型和R．型)，研究表明s一雌马酚对细胞工厂，生产雌马酚成为可能。3-ER的亲和力要比R一型高13倍、比消旋体高2倍；本文旨在构建酿酒酵母工程菌，使其携带s一雌马酚合成途径中3个关键酶的基因。矿、o2和。3，研因此，s一雌马酚的合成及其药理活性成为研究热点。s一究工程菌株的催化性能，为微生物转化大豆苷元到雌雌马酚可通过化学合成或微

5、生物转化的方法获得。以马酚提供科学参考，为实现雌马酚的微生物从头合成大豆苷元、对羟基苯乙酸、问苯二酚等为原料，经过4奠定基础。步或更多步反应得到雌马酚，虽然产量较高，但副产物多，立体选择性低，分离纯化较困难。微生物转化1材料与方法可得到构型单一的产物S一雌马酚。已发现少数肠道1．1材料菌株可转化大豆苷或大豆苷元为s。雌马酚，但这些1．1．1试剂DNA聚合酶、限制性内切酶、FastRNA~菌株培养条件苛刻，并需要两种菌共培养，如共培养ProRedRNA提取试剂盒、PrimeScript@RTreagentkitBifi

6、dobacteriumbreveATCC15700和BifdobacteriumwithgDNAEraserRT—PCR试剂盒等购自大连TaKaRalongumBB536以及Eggerthellasp．Julong732和公司；大豆苷元、二氢大豆苷元和雌马酚标准品购自百Lactobacillussp．Niu．O16⋯等，不适合大规模生产。构灵威公司；其他试剂为国产分析纯试剂。建细胞工厂成为微生物合成雌马酚的研究重点。目1．1．2菌株和质粒本文所用主要菌株及质粒列于收稿日期：2014433—11表1通讯作者，电子信箱：

7、zhaozb@dicp．ac．cn42中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1．34No．42014HHORF．OHHDaidzeinEQL图1大豆苷元到雌马酚的代谢途径Fig．1Theequolbiosyntheticpathwaystartingfromdaidzein表1所用菌株和质粒列表Table1Yeaststrainsandplasmidsusedinthisstudy1．1．3基因和引物以细菌Slackiasp．strainNATFSjcat．de／Start．jsp)优化，由大连Ta

8、KaRa公司合成，得到来源的基因og-、0~-2和0~-3为基础，根据酿酒酵母这些基因的人工合成DNA序列，用于本研究。引物的密码子偏好性经过密码子优化网站(http：／／www．(表2)由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。表2所用引物列表Table2PrimersusedinthisstudyPrimernamesSequences(5一