大豆RAPD分析体系的优化.pdf

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1、鼗黼栽培育种<以大豆为实验材料，通过对PCR反应中主要影响实验结果的几个因素进行优化，获到最佳的反应条件及反应体系，即在总体积为20L的RAPD反应体系中，5种主要成分的最适用量分别是DNA模板20．00ng、M3．00mmol／L、dNTPs10000mol／L、引物0．20“m0l，L、Taq酶1．00U。大豆RAPD分析体系的优化文／于妍唐敬仙RAPD是由美国学者William本原理在于应用RAPD引物随机扩灵敏度高、通用性好及DNA用量较和Welsh领导的2个研究小组于增而产生的DNA片段长度的多态性。少等优势。为确保RAPD分析结果1990年在PCR

2、基础上建立起来的一该标记与其他DNA标记技术相比较，的可靠性、稳定性，以大豆为实验材种新型的DNA分子标记技术。其基具有操作简单、迅速、准确、费用低、料，研究其反应体系中几种因子变化基金项目：吉林省教育厅“十二五”科研计划项目(项目编号为吉教科合字【2012】第515号)，长春科技学院科研启动基金资助项目。11．6g，中谷1穗粒质量17．0g，中谷m穗数X穗粒质量×85．0％／但单穗粒质量较高，为17．0g，所以1穗粒质量较高，比豫谷18重5．4g，1000=2．78X1000Xl1．6×85．0％／667m产量较高，为328．0kg，比豫比豫谷18增加46．

3、6％。1000=274．1kg／667m，中谷1谷18增产53．9kg，增产19．7％。株2．j．5千粒质量豫谷18千粒质量实际测产376．7kg／667m2，计算产草质量、出谷率、千粒质量中谷1都2．6g，中谷1千粒质量2．8g，中谷量为：2．27X10000X17．0X85．0％／较豫谷l8高。1千粒质量比豫谷l8重0。2g。1000=328．01~／667m2。中谷l较豫虽然中谷18生育期稍长，但在实2．5．4株草质量豫谷18单株株草质谷l8产量高53．9l(g，较豫谷18增产际生产上2个品种谷子都是9月18日量11．2g，中谷1单株株草质量15．5g，

4、19．7％。收割的，本示范测产产量为2个品种9中谷1株草质量比豫谷18重4．3g。3小结月17日同期收获产量，如果正常成熟2．5．5出谷率豫谷18出谷率豫谷l8虽然667in成穗较高，收获，产量还会更高。77．9％，中谷1出谷率87．6％，中谷1为2．78万／667m，但单穗粒质量出谷率比豫谷18高。较低，11．6g。所以，667m产量低(作者单位：北京市门头沟区农业2．5．6667m产量豫谷18实际测产于中谷1，为274．1kg。中谷1虽然综合服务中心102300)313．3kg／667m，计算产量为：667667m成穗低，为2．27万／667m，34北京农

5、业2015年7月下旬刊栽培育种覆艘龋巍对扩增结果的影响，以建立最优的反应体系。1材料与方法1．1材料1．1．1实验材料供试品种为普通栽培大豆。1．1．2试剂EDTA、dNTPs、CTAB、氯化镁、TaqDNA聚合酶、Tris—HC1、10×PCRBuffer、氯仿／异戊醇(24：1)、TE缓冲液、琼脂糖、异戊醇及70％乙醇及氯化钾等。1．2实验方法1．2．1DNA的提取利用CTAB法从幼叶中提取基因组DNA。1．2．2RAPD反应体系的建立首先确定总体积为20L的PCR反应体系中模板DNA、氯化镁、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP的最适浓度。2结果与分析2．

6、5Mg2浓度优化Mg浓度会1)dNTPs浓度优化：检验25．00、2．1dNTPs浓度优化设计的6个对PCR扩增产生影响，主要是由于50．00、100．00、125．00、150．00浓度梯度均有条带产生，但浓度在Mg浓度会影响到聚合酶的活性。从mol／L和200．00mol／L6个100．00“mol／L时，扩增的条带最多，实验结果可以看出，Mg用量过高或dNTPs浓度梯度对反应的影响。2)引且清晰。可见，在20“L反应体系中过低时反应效果均不好，故反应体系中物浓度优化：检验0．05、0．10、0．20、dNTPs浓度应设为100．00mol／L。M浓度以3

7、mmol／L左右较理想。0．30、0．40mol／L和0．50mol／L2．2引物浓度优化引物浓度低于3结论6个引物浓度对反应的影响。3)Taq0．05mol／L时，扩增效果不好，在经实验得出，适合大豆RAPD反聚合酶用量优化：检验0．25、0．50、0．10～0．50mol／L则对扩增结果应的最佳体系为：在2OL的反应体0．75、1．00、1．25U和1．50U6影响不大。但是从整体效果来看，认系中含模板DNA20．0ng、引物0．20个Taq酶用量梯度对反应的影响。为在20“L反应体系中引物浓度以“mol／L、dNTPs100．00I

8、mol／L、4)模板

9、浓度优化：检验2．5、5．0、0．20