实验五 细胞染色体数目分析.ppt

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1、实验五细胞染色体分析(秋水仙素裂解法)一、原理细胞处于分裂中期时染色体的长短和大小恰到好处，是研究染色体最好时期。秋水仙素能破坏细胞纺锤体,并阻止其形成,使分裂的细胞停留在分裂中期。秋水仙素使染色体收缩，形成清晰的轮廓。低渗液处理可使细胞肿胀，染色体分散空气干燥使细胞和染色体展平。二、实验材料1、有丝分裂抑制剂100×浓缩的秋水仙素（20μg/ml）：将0.1mg秋水仙素溶于5ml重蒸水中，分装后冰冻保存。2、细胞消化液：0.25%胰蛋白酶溶液3、低渗溶液：0.075mol/LKCl4、固定液：

2、甲醇∶冰乙酸（3∶1混合）5、染液(Giemsa吉姆萨染液)姬姆萨染色液原液：姬姆萨染料0.6g加于50mL甘油中，置55℃～60℃水浴1.5h～2h后，加甲醇50mL，静置24h以上，过滤即成姬姆萨染色液原液，装于棕色瓶内保存备用。10%Giemsa染液：取原液1份加入9份0.01mol/LpH7.2PBS中混匀。6、细胞：Marc-145细胞7、载玻片：4℃预冷三、操作方法秋水仙素处理，使细胞停止分裂收集处理的细胞取对数生长期的Marc-145细胞一瓶，加入秋水仙素到培养液内使终浓度为0.4

3、μg/ml。37℃温箱中继续培养2.5-3h。倾出秋水仙素处理液，用0.25%胰酶溶液消化细胞，细胞消化好后加入DMEM培养液将细胞吹下。1600r/min离心5min收集细胞。低渗处理，使细胞肿胀将细胞沉淀用600μl37℃预温的0.075mol/L的KCl低渗溶液悬浮，混匀后置37℃温育30-35min。加入新配制的固定液（甲醇∶冰乙酸）600μl，混匀，1600r/min离心5min，弃上清液。再加入固定液800μl，轻轻混匀，静置20-30min，1600r/min离心5min，弃上清液

4、。再次加入固定液800μl，轻轻混匀，静置20-30min或4℃过夜，1600r/min离心5min，弃上清液。固定细胞重悬与浓度检测每管加入100μl固定液，混匀。吸取50μl细胞悬液于4℃预冷的干净载玻片上，轻吹液滴，使细胞悬液铺展于玻片上，室温下自然干燥。（在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺开，细胞不重叠，则用同样细胞浓度制备细胞样品。否则要进一步稀释细胞悬液，以达到满意的铺片效果。）染色CD用10%Giemsa染液染10-15min。流水冲洗，自然干燥。观察与计数将载玻片置显微镜油镜下观察

5、计数。观察细胞的标准：细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。染色体形态和分布良好。最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。