斑马鱼原位杂交实验方案.doc

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1、斑马鱼全胚胎原位杂交技术FormDr.Kevin第一节原位杂交技术的历史JosephG.Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献,并发明了原位杂交技术(/门s/?uhybridization,ISH)of

2、Gall同他的研究生MaryLouPaudue和SusanGerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片屮检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。KathleenH.Cox于1984年发明了用单链RNA探针

3、进行原位杂交的技术。ISH技术在斑马鱼屮的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年，NussleinA/olhard等将Cox建立的RNA原位杂交技术进行了改进，用地高辛(digoxin)标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表达。2008年,BernardThisse等将该技术进一步优化，使之更敬感，也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术上要参照Thisse实验家2008年版水(Thisse,C.andThisse,B.,2008,Highresolutioninsituhybridizationon

4、whole-mountzebrafishembryo.Nat.protoc.3:59-69)。第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织屮其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便：同时山于原位杂交不需耍从组织中捉取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的墩感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。整胚原位杂交(whole-mountinsituhybridization)不同丁•一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测

5、的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位。整胚原位杂交指在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，川标记的已知的RNA核昔酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测组织屮相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA.rRNA和tRNA分子。该技术不仅可以用于检测基因的时空表达，为研究该基因功能以及基因分类捉供线索，还对以应用于高通量药物筛选或突变体筛选中，以特异表达的基因标记作为筛选的重耍依据。(图5.1)图5.1斑马鱼整胚原位杂交技术原理。地

6、高辛标记的反义RNA探针9细抱内的mRNA特异性结合，利用免疫组织化学的方法，碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体9杂交的核酸探针特异性结合，然后用碱性磷酸酶的发光底物进行显色。图屮原位杂交结果为24hpfmy/7和fpma基因的表达情况。第三节原位杂交技术的要点由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但娠本方法和应用原则大致相同。主要包括以下几步：杂交前准备（取材和固定）组织的处理（增强核酸探针的穿透性/减低背景染色）杂交反应杂交后处理显示（放射性门显影或非放射性标记的显色）1＞固定原位杂交技术（/门SituHybridization,

7、ISH）/i-固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构,最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平，使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。故对TDNA的足位來说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。而在RNA的定位上，要使RNA的降解减少到最低限度，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间I•分重要，而且取材后应尽快子以冷冻或固定。最常用的固定剂是多聚甲醛，多聚甲醛不会耳蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。我们常采用的方法是将组织固定-T-4%多聚甲醛磷酸缓冲液中置4?C冰箱过夜。各种固定剂

8、均有各自优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin's液、Carnoy's液等能为増加核酸探针的穿透性提供最住条件，但它们不能故大限度地保存RNA,而且对组织结构冇损伤。戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为ISH较为理想的固定剂。2、组织的处理2.1.増强组织的通透性和核酸探针的穿透性此步骤根据应用I占I定剂的种类、组织的种类和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛I占I定的组织由丁•其丄丿蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的

9、増强组织通透性的试剂。増强组织通透性常用的方法如应用